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stickforver

银虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 554.5
散金: 40
帖子: 81
在线: 89.3小时
虫号: 1607703
注册: 2012-02-09
专业: 微生物生理与生物化学

[求助] 如何将保存在克隆载体上的目的基因连接到表达载体上

本人要用到的目的基因被保存在PMD19-T质粒。现今要将该目的基因连接到表达载体上，要怎么操作呢？是直接提质粒酶切获得目的基因呢？还是提质粒后PCR来得到目的基因？如果是提质粒后直接酶切要用什么酶呢？当时目的基因片段与T载体通过的时T-A配对连接上去的，如今要怎么将目的基因切回下来

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Neversaynever.

1楼 2013-03-17 13:31:13

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王文钊-

木虫 (小有名气)

应助: 10 (幼儿园)
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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励积极发贴应助！ 2013-03-17 19:00:25

直接提质粒酶切就好。
但是，要现在你的表达载体上找两个酶切位点，设计引物，做PCR，把酶切位点加到你的目的片段两端，再连到克隆载体上，然后提质粒，做双酶切，得到两端加上酶切位点的目的片段。表达载体同样用这两个酶切，得到载体片段，把你的目的片段和表达载体片段做酶连，就可以连上了。

2楼2013-03-17 14:24:28

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yb19841014

铁杆木虫 (著名写手)

应助: 45 (小学生)
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专业: 河口海岸学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

可以直接pcr把片段扩出来，就能直接连到你的表达载体上了。你可以看下vazyme这个牌子的clonexpress这个酶，很方便的。

3楼2013-03-17 14:56:09

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