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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pET-30a(+)不表达
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田甜思

新虫 (初入文坛)

[求助] pET-30a(+)不表达

一直在做pET-30a(+)这个载体，但是不表达，我是在37度下培养的，都是在OD600=0.6-0.7之间加IPTG的，但就是不表达，质粒测序是正确的。各位帮忙解决下。谢谢！
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1楼 2013-03-12 20:40:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你检测的是全菌蛋白吗？有跑胶的图片吗？
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2楼2013-03-13 00:38:15
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jian520yi

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
蛋白不表达和蛋白本身的性质，蛋白来源物种有很多关系。
不表达是很正常的。
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成功源自于不断的努力和坚持
3楼2013-03-13 08:37:29
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wxl.1989822

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
诱导时采用几个IPTG浓度梯度，不同浓度的IPTG下对表达量有重要影响。
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4楼2013-03-13 10:51:00
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robustli

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-13 20:29:17
以下几点仅供参考：
1，有没有加翻译起始密码子，
2，是不是要表达的蛋白很大，很大的话，不易表达，
3，你怎么知道你得蛋白没表达，你用的事什么标签检测的，有时候光凭借IPTG诱导前后蛋白表达量的变化作为鉴定指标并不是很可靠。
4，建议可以在你的蛋白前面加个GST标签引导表达，虽然没有什么依据，对于某些蛋白可以起到增加表达的作用。
5，就像我以前解答另一个求助的一样，蛋白不表达时，也有可能是稀有密码子导致的。
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immunologyparasite
5楼2013-03-13 11:19:32
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一个问题，你的IPTG在OD0.6-0.7之间加的是什么意思，是说等OD值到了这个值的时候你再加IPTG吗？那你加了之后什么时候收菌测蛋白？
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生物化学与分子生物学
6楼2013-03-13 11:39:13
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田甜思

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-13 00:38:15
你检测的是全菌蛋白吗？有跑胶的图片吗？

测序的是T7启动子以后的以及自己的目的片段（碱基），都是正确的，跑胶的图片和没有加质粒的BL21是一样的
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7楼2013-03-13 16:43:00
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田甜思

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by robustli at 2013-03-13 11:19:32
以下几点仅供参考：
1，有没有加翻译起始密码子，
2，是不是要表达的蛋白很大，很大的话，不易表达，
3，你怎么知道你得蛋白没表达，你用的事什么标签检测的，有时候光凭借IPTG诱导前后蛋白表达量的变化作为鉴定 ...

本身的载体就带有His-tag的呀，我的目的蛋白不含稀有密码子的，上述原因我应该都不存在，但就是表达不出来
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8楼2013-03-13 16:44:49
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分子菜鸟

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一、看看有没有提前终止的地方。
二、看看重组的载体有没有移码的地方。
三、如果都没有。改变诱导条件，加大IPTG的浓度，瓶子中少放培养基并且加大转速。
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9楼2013-03-14 10:52:29
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dhmdddd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
阅读框不会有问题吧?可以考虑把诱导的温度改变下,多做几个温度,我们实验室就遇到常用的表达条件不表达,(25℃,0.4mM IPTG),提高温度后就有目的蛋白了
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上班族，学习ing……
10楼2013-03-14 21:55:11
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