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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 长片段基因3.9K克隆不出来，求助
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生化与分子

新虫 (初入文坛)

[交流] 长片段基因3.9K克隆不出来，求助 已有34人参与

各位坛友好：
    我最近在构建一个重组载体，目的基因片段3.9K，已经克隆了近两周了，使用的是普通Taq酶，一直没有克隆出来，请有经验的坛友帮忙出出主意，谢谢啦！

[ Last edited by silicare on 2014-2-18 at 08:53 ]
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panda73 hy_sandra

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1楼 2013-03-09 10:43:19
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283503264

银虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
21楼: Originally posted by baihaer at 2014-02-07 22:10:58
哥们，我觉得您的68度有点高哈，一般退火温度应该是根据你的引物长度和GC比来推算的，一般公司合成的引物都会附有建议的退火温度。而且72度延伸温度，时间一般不用那么久，一般是1k/1min所以3.9k最多4.5min就可以， ...

这是两步法，68度的是退火和延伸一起来的，所以时间相当于延伸时间。72度不是循环里面的
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Action is the food and drink which will nourish my success.
41楼2014-06-25 13:53:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
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换个酶吧。虽然理论上普通taq可以P出来。再说，3.9kb的片段最好用高保真酶，否则出错了还要重新克隆。
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2楼2013-03-09 11:18:24
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panda73

金虫 (小有名气)
★
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推荐使用Takara的Primestar 高保真，高扩增效率，我们实验室一直用这个酶
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3楼2013-03-09 15:42:47
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hy_sandra

铜虫 (初入文坛)
★
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送鲜花一朵
如果是要?慕M織弄出這麼大的片段，除了酵素要好之外，溶解組織的效率也要好，還有當初我把微量作出的片段?哪z中挖出，再PCR一次, 產量就很多了，可用?斫嬞|體

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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科研是無止盡的
4楼2013-03-09 16:06:52
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