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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 从头设计引物克隆全长基因
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niil

金虫 (正式写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by fengyunqb at 2013-04-27 17:14:59
你好，我在序列的ORF外面距离挺远的，差不多两头都隔了300多bp设计的带酶切位点的上下游引物，结果出来了目的条带，这样子的话出来的产物也比ORF长了不少，这样做表达什么的多余的会有影响吗？还是尽量缩小长度，只 ...

要做表达载体，得根据载体的序列结构来选取合适的片段。绝大多数载体都是要求直接把ORF克隆出来然后接上酶切位点，再插入到载体中去。你的这个片段较长，里面还有非编码区，会影响下一步的表达的。建议你再设计一对引物直接克隆出ORF，以现在克隆出来的这个片段为模板就行。另外，设计引物的时候，选择合适的酶切位点，还要注意和载体的完美的连接，不要产生移码。
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Stop fighting,let it flow.
21楼2013-04-29 13:09:39
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double_sai

新虫 (初入文坛)
最近也做race，真心不好做，来学习的
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22楼2014-09-16 14:57:30
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ff-Wan

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by niil at 2013-03-07 12:02:45
那这样的话，在ORF两端设计引物，就是扩起始密码和终止密码之间的片段就行。
引物的位置不用严格限定位于这两个位点，能在ORF外侧设计引物最好，要是在ORF内侧设计引物，与起始密码和终止密码差个10-20bp没有问题 ...

你好，我也是类似的问题，还请指导一下。从转录中获取目的基因的部分序列，要做这个基因的克隆，后面在组织中做表达，但不一定会做race。现在不知道怎么用这个序列设计引物，ORF finder 上预测显示有一条长链的ORF区，序列里有起始密码子和终止子。不知道引物设计是要扩整个部分序列（1330bp）还是只扩预测的ORF区（640bp），引物要在哪里设计合适？
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23楼2019-07-11 14:01:41
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