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小彪彪

新虫 (初入文坛)

[求助] 这个提质粒DNA的原理是什么?

请问一下这个方法提质粒DNA的原理是什么?最好详细点,说说试剂和温浴的作用。
这方法是提取大肠杆菌ColV质粒的,提取后用于PCR。

这样能提取出质粒么?我看书本上的方法都很麻烦的,而且这方法好像并没有弃掉任何试剂。
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peakg7

新虫 (小有名气)

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只看到,蛋白酶k可能是裂解细菌的。这些东西后面都灭活了,不影响你后面的实验,应该没关系
2楼2013-03-06 19:28:05
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zltj2008

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这应该不是正规专门提质粒的方法,这种方法就是把菌体裂解开,把包括基因组DNA和质粒DNA都释放出来,电泳时应该都可以看到,然后可以做PCR检测或酶切。我印象中,这种方法应该算是构载体时的快速验证用的,比你常规提质粒后酶切或PCR什么的能省点时间。
3楼2013-03-07 09:00:12
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
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小彪彪: 金币+2, 有帮助, 谢谢 2013-03-12 15:06:04
原理跟常规试剂盒是一样的,都是先裂解菌,再使蛋白和DNA分离。
只是,这里挑取的事单菌落,最后用几十微升的水稀释,蛋白浓度已经被稀释的非常低了,因此无需弃掉什么。
4楼2013-03-07 09:27:36
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niil

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小彪彪: 金币+2, 有帮助, 最好详细点哦 2013-03-12 15:05:21
这个方法并不是针对质粒提取的。方法的目的是把细菌细胞裂解,释放出细胞内部的DNA,包括质粒DNA。这样裂解得到的混合液最后可以取1-5微升作为模板进行PCR。
这跟菌落PCR的想法差不多,只不过多了这么一步裂解细菌细胞的步骤。
不过,这个方法使用蛋白酶k貌似不太合适,用溶菌酶可能会更好点,破坏细菌细胞的细胞壁估计会更重要点。
Stop fighting,let it flow.
5楼2013-03-07 09:50:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


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小彪彪: 金币+1, 有帮助, 最好详细点哦 2013-03-12 15:05:40
这个方法貌似只是把细菌裂解。蛋白酶K是核酸酶抑制剂。不过体系里面一般裂解菌的SDS/溶菌酶/碱什么的都没有,光靠加热80°C十分钟,感觉裂解效果不会很好吧。
6楼2013-03-07 10:40:27
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