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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB没有条带啊
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liusiapril

木虫 (小有名气)

[求助] WB没有条带啊

今天做了一次WB。用的蛋白和抗体在此之前试着做过一次DOT BLOT，把抗体的使用条件都摸索了一遍，且取得了较好的结果。但是相同的抗体和蛋白一起来做WB，显影时一条条带也看不到。蛋白上样量比以前还增加了。我在想是转膜的问题吗？我的目的条带最大100kD，最小17kD,0.45的膜湿转，100mA,2小时。求助经验人士给予指导，谢谢
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1楼 2013-03-05 21:09:55
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liusiapril

木虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-09 01:27:02
你不是说做过dot blot吗？那时你点了多少蛋白？此外，你用的抗体的特异性怎么样？如果特异性差的抗体dot blot的结果不怎么可信。...

嗯，我和老师讨论后的结果也是把重点放在WB上。Dot blot当时只上了5微克的蛋白，虽然曝光很淡，但是能看到。当时想着WB把蛋白都分开了，可能单独一条带出来就真的会弱点呢，毕竟Dot blot时各种蛋白都混一起了。。经过多次摸索实验，我觉得一抗特异性可能不是很好。但是因为蛋白特殊性，也没别的抗体可选择…

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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22楼2013-03-09 23:57:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liusiapril: 金币+1 2013-03-06 08:37:17
如果怀疑是转膜的问题，可以跑预染的marker，看看marker转的情况。或者转完膜后用丽春红染一下膜看看。
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2楼2013-03-06 07:33:04
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liusiapril

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-06 07:33:04
如果怀疑是转膜的问题，可以跑预染的marker，看看marker转的情况。或者转完膜后用丽春红染一下膜看看。

膜上有72和95两条带，小带有部分在滤纸上有印记。但是大的那个条带在膜上也没有出现，今天试着用丽春红染色看看。
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3楼2013-03-06 08:38:29
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zx1984

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liusiapril: 金币+1 2013-03-06 10:45:32
确定用的膜对了，然后转膜时不要有气泡，抗体孵育的时候不要错了
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4楼2013-03-06 09:36:16
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