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nickey910

木虫之王 (职业作家)

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[交流] 怎样保证离体大鼠脑组织中ATP不被分解？

各位战友，有谁做过脑缺血再灌注试验，离体脑组织中ATP的液相含量测定，怎样保证离体大鼠脑组织中ATP不被分解，现在我用的样品处理方法是取0.3g脑组织，立即用0.5mol/L高氯酸溶液2ml在冰水浴充分匀浆静置10min，0~4℃以3000rpm离心10min，取上清加入0.5mol/L氢氧化钾调ph为6.5，再以10000rpm离心10min，取上清进样走液相。液相色谱条件为色谱柱Hypersil ODS C18 250mm*4.6mm，柱温40℃，检测波长254nm，流动相A：70mmol/L磷酸二氢钠+3mmol/L四丁基溴化铵（调ph6.5），流动相B：甲醇。A:B=90:10，流速1ml/min。
现在的问题是对照品出峰顺序为AMP 7.3min，ADP 14.4min，ATP 27.2min，分离效果挺好，但是样品中的ADP和ATP检测不出来，基线就是平的，很郁闷，不知是哪里出了问题，是ATP分解了吗，还是别的原因，请帮忙分析一下，非常感谢

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1楼 2013-03-05 14:42:11

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wangyuanji

银虫 (小有名气)

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★
nickey910(金币+1): 谢谢参与

我们这边做过这几种物质的测定，但最终ADP没有测出来，有可能是稳定性极差。
给你一个样品前处理方法，供你参考：取大鼠心脏，称量，按一比二的比例加7%高氯酸沉淀蛋白并且匀浆，低温10000g离心20分钟，取上清，调节PH=6~7，再低温4000g离心10分钟，取上清，-200C保存。测试样本为处理好的细胞裂解液。
还有，你的色谱条件中柱温是否偏高？40摄氏度？调低试试看。