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fayzhao

金虫 (小有名气)

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[求助] 双酶切后切胶回收

各位虫友好：
目前，我正在做质粒双酶切，体系40ul：
dd水                      补足40ul
10Xtango buffer    4ul
质粒                      2ug
kpnI                      2ul
bglII                      2ul
37℃反应5h,电泳检测图如下：

目的是为了回收目的条带（300多bp），切胶回收用了takara的和axygen的，都没有回收到，跑胶没有任何条带。接下来我要做的是将目的基因连接到表达载体中，回收不到怎么办哪？求帮助！！！

2013-1-20双酶切_副本.jpg

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1楼2013-01-23 17:10:19

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酶切专家

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-24 10:20:46

一般克隆时，设计一个连接反应，载体需要100ng左右，根据分子数比例（外源片段是载体的3-10倍），事实上，需要的外源片段的绝对量很少（一般不超过50ng).
但考虑到回收的小片段定量的准确性，一般回收到的小片段浓度需要达到10ng/ul。而且再考虑回收时体积最少20ul，而小片段的回收效率一般很难超过50%，因而，回收时小片段的理论量至少是10ng/ul X 20ul X 2 =400ng。由于你的小片段只占你的载体分子的1/10---1/15，因而，你进行酶切时就需要载体至少4--6ug.否则，你很难回收到足够量的小片段进行随后的连接。

为了保证载体的完全酶切，你可能需要利用double digestion disigner精确计算酶切所需要的酶量。