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ying_cheng金虫 (小有名气)
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[求助]
液相色谱分析氨基酸的衍生方法已有3人参与
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查过一些文献，有用OPA、DNFB、FITC、FMOC等等衍生的，可是每种方法似乎都有其优劣，比如OPA衍生产物不稳定，要尽快进行检测；DNFB的衍生产物稳定，但是毒性很大；FITC用的人也挺多的，但是干扰因素多，还要有真空蒸发装置；不知道文献调研的对不对，在这里请教各位做过类似实验的前辈们，请你们来评价一下吧，顺便给点建议，如果直接有分析方法那当然最好啦……谢啦…… 实验室只有PDA的检测器，没有荧光的，请教一下各位大侠，用哪种衍生试剂产物更稳定、更适合用紫外检测器？ |
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【答案】应助回帖
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做氨基酸分析有一段时间了，各种各样的方法也试过了，仪器也买过了，谈下个人经验 在选取方法之前，我认为首先应该明确目标氨基酸的种类、数量。 如果仅数种氨基酸，如常见的丝、谷、甘、苏、亮、精、鸟，那都不是事儿，OPA、FMOC都没问题（成本低）。需要注意的是这两种衍生都不是很稳定，最好是配合自动进样器进行进样前的自动衍生。（安捷伦和Waters都有标准的自动进样器在线衍生方法，可以参考；PS.推荐用资生堂的MG2柱子，耐受性强一些） 如果加上一些需要二次衍生的就比较麻烦了，特别是半胱，用在线衍生很难保证精密度。可以使用Waters的Accq-tag。这个方法比较稳定，对数量不多的氨基酸也比较有效。最大的缺点是成本较高，连试剂代柱子，每针成本在20块钱左右。另外，也是我不能忍受的一点，对于18种以上的氨基酸分析分离度不好。Waters回应的解决方案是需要买其UPLC-I Class的仪器，仪器和色谱柱的成本都比较以往翻了一番。 无奈于Waters欺负人的行为，花60万买了一台赛卡姆的氨基酸分析仪，结果也没比i Class的UPLC便宜多少。不过现在可以做25种氨基酸的分析了，重现性也比之前有大幅提高。也算比Waters的要强一些。 氨基酸分析仪其实也是HPLC的专业细分产物，主要是利用可控的自动柱前和柱后两次衍生，配合离子交换色谱柱来分离和检测。现在国内市面上的氨基酸分析仪主要是日本日立、英国百康、和赛卡姆三家，日立的要好一些，价格也很贵。同时，还分蛋白水解系统和生理体液系统。蛋白水解的能同时分17种氨基酸，生理体液的最多能分30~34种。目前用了一年，使用进口试剂每针要十几块，国产试剂有一点小干扰，但成本只有不到一块。 另外一种方法也实验了一下，但是没有做下去。就是用离子色谱仪来做。基本上要戴安的ICS3000或5000才可以，因为需要走梯度。期初分离还不错，重现性也行，但是因为进样浓度高，柱子没进到几百针就不行了。再买柱子要一万多，而且到货时间长达一个半月，就放弃了。 |
11楼2014-05-17 17:11:56
ruiyi1101
新虫 (小有名气)
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xbqewpq: 金币+3, 感谢应助，欢迎常来分析版交流~ 2013-01-18 10:44:02
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xbqewpq: 金币+3, 感谢应助，欢迎常来分析版交流~ 2013-01-18 10:44:02
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首先声明本人不是替Waters公司做广告，是用过他们家的这个产品！ 建议楼主采用Waters的AccQ-Tag柱前衍生化法，这个方法可以用紫外检测器，衍生化反应快速，衍生化得到的产物是很稳定的，室温放置2到3天都没有问题的。 另外，Waters公司有一个AccQ-Tag的氨基酸分析包，提供下列测试所需要的实验必需品： 1. 色谱柱 2. 17种水解氨基酸的对照品 3. 衍生化反应所需的：衍生化试剂、稀释剂、缓冲液 4. HPLC测试用的浓缩流动相，使用时用水稀释即可（该流动相的配比在USP通则1052中有描述，但是强烈建议购买，自己配制的效果没有商品化销售的好） 5. 一套完整的色谱分析方法，如果楼主拥有Waters的HPLC，根据不同的仪器型号直接用使用手册中的色谱条件（梯度洗脱程序），Waters公司确保该方法可以在Waters的HPLC上运行，客户购买整套分析包、并且使用Waters仪器，如果无法重复该方法Waters可以提供一次免费的现场解决问题。 当然，用安捷伦的HPLC也是能够达到预期的分离效果，但是需要根据仪器的性能调整一下梯度洗脱程序。 另外，建议楼主看一下USP通则1052，该通则中有氨基酸分析的水解方法、验证、定量计算、衍生化方法等内容可供参考，Waters的AccQ-Tag方法也被收载，规定用荧光检测器（主要是过量的衍生化试剂副产物的峰，在荧光检测器下的响应很小，有利于氨基酸的分离）。 希望对你有帮助！ |
2楼2013-01-17 22:12:17
3楼2013-01-18 10:39:44
ying_cheng
金虫 (小有名气)
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4楼2013-01-18 12:00:28