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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 融合PCR问题求助
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ceyuandu

新虫 (初入文坛)

[求助] 融合PCR问题求助

亲 请问两段基因分别在不同的载体中以质粒的形式存在
   两段基因 （注：大小分别为700多bp和150bp左右）中间设计了45bp序列相同。
   是否可以直接以这两个质粒为主要模板，在加上两端的引物直接PCR
     请问此方法可以吗，可以P处来嘛？
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1楼2013-01-16 16:57:06
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我是传奇456

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
ceyuandu: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-01-17 16:26:51
引用回帖:
4楼: Originally posted by ceyuandu at 2013-01-17 09:56:26
亲 我手里 只有这两个质粒
没有办法  不能把他们直接变成PCR产物的形式融合PCR

请问请我直接用两个质粒 加上融合PCR两端的引物 能否P出来...

你的意思是，质粒中的两个片段本来就含有重叠部分吗？如果是这样，那你可以试试直接用两端引物P，不过退火温度就有3个点，即正向，重叠，还有反向。
一般来说，重叠部分的退火温度是最高的。要小心重叠部分粘贴不上。
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5楼2013-01-17 10:59:25
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我是传奇456

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以，注意退火温度的把握，可以在第一步PCR时做个TOUCHDOWN。
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2楼2013-01-16 20:57:58
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我是传奇456

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-16 21:39:38
看错了，一般是分为两步做:
第一步PCR，分开扩增，用正向引物+重叠部分扩增片段1，用重叠部分+反向引物扩增片段2，这一步做个touchdown；
第二步PCR，以第一步两PCR产物为模板，用正向引物和反向引物扩增。
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3楼2013-01-16 21:01:28
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ceyuandu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 我是传奇456 at 2013-01-16 21:01:28
看错了，一般是分为两步做:
第一步PCR，分开扩增，用正向引物+重叠部分扩增片段1，用重叠部分+反向引物扩增片段2，这一步做个touchdown；
第二步PCR，以第一步两PCR产物为模板，用正向引物和反向引物扩增。

亲 我手里 只有这两个质粒
没有办法  不能把他们直接变成PCR产物的形式融合PCR

请问请我直接用两个质粒 加上融合PCR两端的引物 能否P出来
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4楼2013-01-17 09:56:26
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