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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 关于重组表达纯化出的蛋白的酶活性问题
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ice清玉

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于重组表达纯化出的蛋白的酶活性问题

请问：如果重组表达纯化的蛋白是一种酶，这种酶没有辅因子的话就没有活性，那么表达纯化透析出来的蛋白有活性吗？换句话说就是，重组表达出来的蛋白包含辅因子吗？还是需要后续实验加上辅因子？

还有就是如果这个酶是二聚体或者四聚体的话，那么表达纯化复性出来的是单体还是就是x聚体了？%>_<%

想不明白这个问题...+_+

请大家都说说看昂...%>_<%
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1楼 2013-01-11 16:12:15
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
ice清玉(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-04-26 21:09:39
如果你知道每个酶分子结合FAD的数目，可以按照mol比加在透析液里。或者你先大量纯化出没有FAD的酶，定量后再取一部分去结合FAD，再与原来的apo形式的酶比较酶活性。
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7楼2013-01-13 01:11:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ice清玉(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-04-26 21:09:21
在小量表达成活性形式时，cofactor一般是利用宿主合成的结合上去的。但大量表达时往往形成不具活性的包涵体，或者由于大量表达，即使可溶，宿主合成的cofactor是不够的，需要复性人为加入才有活性。如果酶是寡聚体，一般在复性后就会形成多聚体的形式。
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3楼2013-01-12 07:26:28
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ice清玉

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-12 07:26:28
在小量表达成活性形式时，cofactor一般是利用宿主合成的结合上去的。但大量表达时往往形成不具活性的包涵体，或者由于大量表达，即使可溶，宿主合成的cofactor是不够的，需要复性人为加入才有活性。如果酶是寡聚体， ...

我觉着也应该是这样，可是我的蛋白在包涵体里表达，纯化出来以后检测竟然有活性，所以我很疑惑。我对自己的检测方式也不是很有信心。我再表达一批蛋白试着在复性透析液里加入辅因子看看有没有什么区别吧。O(∩_∩)O谢谢
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4楼2013-01-12 10:58:02
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by ice清玉 at 2013-01-12 10:58:02
我觉着也应该是这样，可是我的蛋白在包涵体里表达，纯化出来以后检测竟然有活性，所以我很疑惑。我对自己的检测方式也不是很有信心。我再表达一批蛋白试着在复性透析液里加入辅因子看看有没有什么区别吧。O(∩_∩) ...

你是指复性时没加辅助因子，但还是有活性的？这还真有些意外。不管怎么说，得到有活性的产物还是很好的。
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5楼2013-01-12 11:45:20
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