24小时热门版块排行榜    

查看: 1634  |  回复: 17
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

ym6104

金虫 (小有名气)

[求助] 长片段的连接转化问题,望大侠们赐教!

新手一枚,现在在扩两个3000bp左右的基因,做TA克隆,PCR的条带很亮,胶回收后跑琼脂糖检测条带也挺亮,用的是TAKARA 的LA TAQ,之后用TAKARA的PMD-19连接过夜,再用全式金的T1感受态转化,涂板之后也长菌了,但没有之前扩短片段的时候多,做菌落PCR检测却什么条带也没有。现在觉得是片段太长没有连接上,所以想请教一下各位,有什么改进的办法吗?还是说得分段扩增,那分段的话在分的片段的太小和引物设计上有什么要求吗?
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ym6104

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by kangqx2212 at 2013-01-10 22:26:13
直接测序吧,两头测一个反应先。

嗯嗯,明天重做一遍,直接测序试试。
8楼2013-01-10 23:00:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答

昺昺

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
既然你能一次把3Kb的片段扩增出来,没有必要再分段扩增。就算分段扩增出来,还是得拼接在一起然后再连接。
我觉得相对于大片段来说,你的连接载体(T载体)可能效率没那么高,我建议换更高效率的连接载体
太阳出来,星星要走。
2楼2013-01-10 20:50:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
ym6104: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-11 09:33:37
你做菌落PCR用的什么引物啊?如果是和克隆一样的引物是有可能扩不出来的,从质粒上扩出3000和从菌液中扩出3000还是会有点差别的
一般做菌落PCR一端用载体上的通用引物一端用片段上的引物,片段小一些保证效率
比如一个T7正向+基因5‘端的反向引物  基因3‘端的正向引物+BGH反向引物
这样把方向确定好 选对的测序
3楼2013-01-10 21:05:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ym6104

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 昺昺 at 2013-01-10 20:50:18
既然你能一次把3Kb的片段扩增出来,没有必要再分段扩增。就算分段扩增出来,还是得拼接在一起然后再连接。
我觉得相对于大片段来说,你的连接载体(T载体)可能效率没那么高,我建议换更高效率的连接载体

请问有什么好的推荐吗?我也想换一个试试。
4楼2013-01-10 21:10:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 328求调剂,英语六级551,有科研经历 +5 生物工程调剂 2026-03-17 9/450 2026-03-21 23:32 by zhujy1982
[考研] 考研调剂 +3 呼呼?~+123456 2026-03-21 3/150 2026-03-21 20:04 by 无际的草原
[考研] 一志愿东华大学控制学硕320求调剂 +3 Grand777 2026-03-21 3/150 2026-03-21 19:23 by 简之-
[基金申请] 山东省面上项目限额评审 +3 石瑞0426 2026-03-19 3/150 2026-03-21 18:59 by RRRKKK
[考研] 求调剂 +4 要好好无聊 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:57 by 学员8dgXkO
[考研] 0805 316求调剂 +3 大雪深藏 2026-03-18 3/150 2026-03-21 18:55 by 学员8dgXkO
[考研] 313求调剂 +4 肆叁贰壹22 2026-03-19 4/200 2026-03-21 17:33 by ColorlessPI
[考研] 265求调剂 +12 梁梁校校 2026-03-19 14/700 2026-03-21 13:38 by lature00
[考研] 310求调剂 +3 baibai1314 2026-03-16 3/150 2026-03-21 03:56 by JourneyLucky
[考研] 二本跨考郑大材料306英一数二 +3 z1z2z3879 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:29 by JourneyLucky
[考研] 材料专业求调剂 +6 hanamiko 2026-03-18 6/300 2026-03-21 00:24 by JourneyLucky
[考研] 材料专硕英一数二306 +7 z1z2z3879 2026-03-18 7/350 2026-03-20 23:48 by JourneyLucky
[考研] 294求调剂材料与化工专硕 +15 陌の森林 2026-03-18 15/750 2026-03-20 23:28 by JourneyLucky
[考研] 一志愿苏州大学材料求调剂,总分315(英一) +5 sbdksD 2026-03-19 5/250 2026-03-20 22:10 by luoyongfeng
[考研] 一志愿中南化学(0703)总分337求调剂 +8 niko- 2026-03-19 9/450 2026-03-20 21:57 by luoyongfeng
[考研] 一志愿中国海洋大学,生物学,301分,求调剂 +5 1孙悟空 2026-03-17 6/300 2026-03-19 23:46 by zcl123
[考博] 申博26年 +3 八6八68 2026-03-19 3/150 2026-03-19 19:43 by nxgogo
[考研] 材料与化工求调剂 +7 为学666 2026-03-16 7/350 2026-03-19 14:48 by 尽舜尧1
[考研] 0703化学调剂 +5 pupcoco 2026-03-17 8/400 2026-03-19 13:58 by houyaoxu
[硕博家园] 湖北工业大学 生命科学与健康学院-课题组招收2026级食品/生物方向硕士 +3 1喜春8 2026-03-17 5/250 2026-03-17 17:18 by ber川cool子
信息提示
请填处理意见