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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RNA降解，求高人分析一下原因。
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hjhjhj6

金虫 (小有名气)

[求助] RNA降解，求高人分析一下原因。

新手，提的斑马鱼肝脏和卵巢的RNA，takara的trizol，操作应该问题不大，枪头都是无RNA酶的。取样是新鲜样，20mg左右，1mltrizol，液氮和匀浆器法都试过，电泳图都差不多，5s条带特别亮。电泳液是TAE，DEPC水配置，找了很多原因，该注意的感觉都注意到了，DEPC处理什么的，但依然降解。氯仿、异丙醇没预冷，乙醇是-4度保存的，这个有影响吗？跟着别人的一起做也降解，别人的还好，是不是组织快还需要再小一点？
希望大家交流一下经验，一开始也提不好，后来把问题解决了的朋友说说问题出在哪里，供我参考。谢谢！
IM001245.Tif(2.66MB)
http://kuai.xunlei.com/d/LnU4DTfp.pPqUAQA570?p=130497
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HakunaMatata~
1楼 2013-01-07 17:27:00
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
hjhjhj6: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 我现在做的好一些了，我觉得是跑胶的问题，正在改进中。 2013-01-14 20:37:59
hjhjhj6: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-15 17:43:55
最有可能是：1、你稀释RNA的DEPC水出问题，RNA被降解；2、电泳液出问题了，RNA在电泳过程中被降解
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5楼2013-01-11 14:44:16
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普通回帖

616057157

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hjhjhj6: 金币+3, ★有帮助 2013-01-14 20:43:44
hjhjhj6: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-15 17:44:09
亲，你在提取过程中要4度离心，且操作越快越好。你也要注意细胞数目和Trizol试剂的比列，裂解彻底，提取的RNA条带才好。
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不曾拥有何谈失去，不必伤心！！！
2楼2013-01-08 08:25:22
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hjhjhj6

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 616057157 at 2013-01-08 08:25:22
亲，你在提取过程中要4度离心，且操作越快越好。你也要注意细胞数目和Trizol试剂的比列，裂解彻底，提取的RNA条带才好。

谢谢  但这些都注意了啊。。。组织相对来说已经很小很小了  会不会是DEPC水的问题？  我水都是自己配置的  不是买的现成的
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HakunaMatata~
3楼2013-01-08 11:06:00
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言默haha

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
hjhjhj6: 金币+5, ★★★很有帮助, 嗯，我换了下水，感觉好一些 2013-01-14 20:36:56
hjhjhj6: 金币+5 2013-01-15 17:44:21
你应该检查一下使用水的质量 可能水已经污染了
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4楼2013-01-11 10:57:54
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475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
hjhjhj6: 金币+3 2013-01-14 20:44:16
hjhjhj6: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-01-15 17:44:40
提RNA是挺难弄得，但是如果严格按照说明书就是没有问题的。
首先你样品研磨后一定要马上加上trizon
台子也要过夜照
最好用专用的工作台
整个过程要快就行了
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
6楼2013-01-11 15:59:49
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hjhjhj6

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yesali at 2013-01-11 14:44:16
最有可能是：1、你稀释RNA的DEPC水出问题，RNA被降解；2、电泳液出问题了，RNA在电泳过程中被降解

我发现提的RNA跑胶出来差别很大，本来跑出来只有一条带的，再跑一次又变好了；本来5S条带很亮的，第二次跑结果又很好，但跑出好结果的情况不太稳定。电泳缓冲液是DEPC水配的，配胶是0.56g+40mlTAE，大概1.5%，147v跑了10分钟，问题出在哪呢？
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HakunaMatata~
7楼2013-01-14 20:41:56
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
hjhjhj6: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-01-15 09:53:03
hjhjhj6: 金币+6, ★★★★★最佳答案 2013-01-15 17:44:47
这有可能是跑胶的过程中降解了，有可能是点样的过程中混进RNA酶了，总之，跑胶的环节也要尽量的注意
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8楼2013-01-14 21:03:46
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hjhjhj6

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 追梦的人1987 at 2013-01-14 21:03:46
这有可能是跑胶的过程中降解了，有可能是点样的过程中混进RNA酶了，总之，跑胶的环节也要尽量的注意

点样过程中混入RNA酶的可能性大不？  是不是Loading Buffer不太好？
还是胶的问题？
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HakunaMatata~
9楼2013-01-15 09:54:34
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by hjhjhj6 at 2013-01-15 09:54:34
点样过程中混入RNA酶的可能性大不？  是不是Loading Buffer不太好？
还是胶的问题？...

也有可能的，loadingbuffer尽量单独用，和跑DNA的分开，buffer与RNA混合时，在无RNA酶的小pcr管里混合，还有就是整个过程要快，这样会好点
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10楼2013-01-15 14:03:49
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