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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 最近做WB实验，膜总是很花
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乖乖宝贝

金虫 (小有名气)

[求助] 最近做WB实验，膜总是很花

最近在做WB实验，可是最后显影发现整张膜总是花花的，好像蛋白跑得到处都是，但是目的条带也出现了。是不是洗膜不够彻底，可是之前做都是很好的实验结果，最近一直重复不出来，很郁闷……

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尽自己最大的努力，优秀毕业！
1楼 2012-12-16 00:30:24
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乖乖宝贝

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yj279685695 at 2012-12-16 15:31:36
这个应该是封闭的问题，我们通常封闭后直接孵育抗体，且用封闭液稀释抗体，当然这种做法在一抗和二抗浓度高的时候也会出现背景高，但是你之前的实验已经证实非抗体浓度影响。所以应该优化封闭措施

我用的是碧云天的封闭液，以前一直都用这个封闭液，也没有出现过这样的情况。有没有大侠也遇到过一样的花膜情况，后来是怎么改进的……
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尽自己最大的努力，优秀毕业！
7楼2012-12-16 15:38:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
乖乖宝贝: 金币+5, 谢谢回复 2012-12-16 10:36:37
这个一抗以前做过吗？感觉像是二抗过量了。
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2楼2012-12-16 01:04:38
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乖乖宝贝

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-16 01:04:38
这个一抗以前做过吗？感觉像是二抗过量了。

做过的，条件一摸一样，是内参！之前条件都摸清楚了。但是最近做WB，不管什么条件最终显影膜都是这样花花的。随便说一下，我用碧云天的封闭液封闭后，我还是用TBST洗3次，才孵育的。是不是不该洗？
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尽自己最大的努力，优秀毕业！
3楼2012-12-16 10:38:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 乖乖宝贝 at 2012-12-16 10:38:52
做过的，条件一摸一样，是内参！之前条件都摸清楚了。但是最近做WB，不管什么条件最终显影膜都是这样花花的。随便说一下，我用碧云天的封闭液封闭后，我还是用TBST洗3次，才孵育的。是不是不该洗？...

如果一抗以前做过的，可能是二抗的问题，你可以借别的实验室的二抗试试。封闭后一般洗两次就够了，有人这一步不洗。关键洗膜是在一抗孵育后和二抗孵育后，如果洗不干净可能会造成高背景。
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4楼2012-12-16 11:26:50
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