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乖乖宝贝

金虫 (小有名气)

[求助] 最近做WB实验,膜总是很花

最近在做WB实验,可是最后显影发现整张膜总是花花的,好像蛋白跑得到处都是,但是目的条带也出现了。是不是洗膜不够彻底,可是之前做都是很好的实验结果,最近一直重复不出来,很郁闷……

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尽自己最大的努力,优秀毕业!
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yj279685695

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
乖乖宝贝: 金币+3, 有帮助, 谢谢回复! 2012-12-16 15:32:42
yqbter: 金币+5, 鼓励发帖! 2012-12-16 22:36:12
这个应该是封闭的问题,我们通常封闭后直接孵育抗体,且用封闭液稀释抗体,当然这种做法在一抗和二抗浓度高的时候也会出现背景高,但是你之前的实验已经证实非抗体浓度影响。所以应该优化封闭措施
东临碣石,以观沧海
6楼2012-12-16 15:31:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
乖乖宝贝: 金币+5, 谢谢回复 2012-12-16 10:36:37
这个一抗以前做过吗?感觉像是二抗过量了。
2楼2012-12-16 01:04:38
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乖乖宝贝

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-16 01:04:38
这个一抗以前做过吗?感觉像是二抗过量了。

做过的,条件一摸一样,是内参!之前条件都摸清楚了。但是最近做WB,不管什么条件最终显影膜都是这样花花的。随便说一下,我用碧云天的封闭液封闭后,我还是用TBST洗3次,才孵育的。是不是不该洗?
尽自己最大的努力,优秀毕业!
3楼2012-12-16 10:38:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 乖乖宝贝 at 2012-12-16 10:38:52
做过的,条件一摸一样,是内参!之前条件都摸清楚了。但是最近做WB,不管什么条件最终显影膜都是这样花花的。随便说一下,我用碧云天的封闭液封闭后,我还是用TBST洗3次,才孵育的。是不是不该洗?...

如果一抗以前做过的,可能是二抗的问题,你可以借别的实验室的二抗试试。封闭后一般洗两次就够了,有人这一步不洗。关键洗膜是在一抗孵育后和二抗孵育后,如果洗不干净可能会造成高背景。
4楼2012-12-16 11:26:50
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