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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 最近做WB实验，膜总是很花
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乖乖宝贝

金虫 (小有名气)

[求助] 最近做WB实验，膜总是很花

最近在做WB实验，可是最后显影发现整张膜总是花花的，好像蛋白跑得到处都是，但是目的条带也出现了。是不是洗膜不够彻底，可是之前做都是很好的实验结果，最近一直重复不出来，很郁闷……

1214-2.jpg
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尽自己最大的努力，优秀毕业！
1楼 2012-12-16 00:30:24
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lidong.0107

铜虫 (小有名气)
我也遇到过这样的情况，有两种原因，一是封闭后和敷完抗体后没有洗干净，二是显影是显影液加多了！wb不能着急，慢慢做，越急越不出结果。加油！
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

乖乖宝贝
11楼2012-12-19 10:37:39
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
乖乖宝贝: 金币+5, 谢谢回复 2012-12-16 10:36:37
这个一抗以前做过吗？感觉像是二抗过量了。
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2楼2012-12-16 01:04:38
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乖乖宝贝

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-16 01:04:38
这个一抗以前做过吗？感觉像是二抗过量了。

做过的，条件一摸一样，是内参！之前条件都摸清楚了。但是最近做WB，不管什么条件最终显影膜都是这样花花的。随便说一下，我用碧云天的封闭液封闭后，我还是用TBST洗3次，才孵育的。是不是不该洗？
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尽自己最大的努力，优秀毕业！
3楼2012-12-16 10:38:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 乖乖宝贝 at 2012-12-16 10:38:52
做过的，条件一摸一样，是内参！之前条件都摸清楚了。但是最近做WB，不管什么条件最终显影膜都是这样花花的。随便说一下，我用碧云天的封闭液封闭后，我还是用TBST洗3次，才孵育的。是不是不该洗？...

如果一抗以前做过的，可能是二抗的问题，你可以借别的实验室的二抗试试。封闭后一般洗两次就够了，有人这一步不洗。关键洗膜是在一抗孵育后和二抗孵育后，如果洗不干净可能会造成高背景。
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4楼2012-12-16 11:26:50
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遥控器68

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
乖乖宝贝: 金币+3, ★有帮助, 谢谢回复哦…… 2012-12-16 15:33:55
yqbter: 金币+2, 鼓励发帖！ 2012-12-16 22:36:01
个人觉得是封闭不好，封闭时候一定摇的均匀。
洗三次应该是没什么问题。如果是没洗好，为什么有的地方很干净有的地方高背景呢。
建议封闭这一步楼主多思考下。
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5楼2012-12-16 12:57:17
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yj279685695

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
乖乖宝贝: 金币+3, ★有帮助, 谢谢回复！ 2012-12-16 15:32:42
yqbter: 金币+5, 鼓励发帖！ 2012-12-16 22:36:12
这个应该是封闭的问题，我们通常封闭后直接孵育抗体，且用封闭液稀释抗体，当然这种做法在一抗和二抗浓度高的时候也会出现背景高，但是你之前的实验已经证实非抗体浓度影响。所以应该优化封闭措施
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东临碣石，以观沧海
6楼2012-12-16 15:31:36
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乖乖宝贝

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yj279685695 at 2012-12-16 15:31:36
这个应该是封闭的问题，我们通常封闭后直接孵育抗体，且用封闭液稀释抗体，当然这种做法在一抗和二抗浓度高的时候也会出现背景高，但是你之前的实验已经证实非抗体浓度影响。所以应该优化封闭措施

我用的是碧云天的封闭液，以前一直都用这个封闭液，也没有出现过这样的情况。有没有大侠也遇到过一样的花膜情况，后来是怎么改进的……
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尽自己最大的努力，优秀毕业！
7楼2012-12-16 15:38:11
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yj279685695

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 乖乖宝贝 at 2012-12-16 15:38:11
我用的是碧云天的封闭液，以前一直都用这个封闭液，也没有出现过这样的情况。有没有大侠也遇到过一样的花膜情况，后来是怎么改进的……...

要不要用脱脂奶粉试一下？封闭少洗或者不洗，孵抗体的时候常规洗涤
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东临碣石，以观沧海
8楼2012-12-16 15:51:35
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porphybaby

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 鼓励发帖交流 2012-12-17 07:21:12
乖乖宝贝: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢，我今天再做已经换新的封闭液啦。明天看看结果，我看着Marker转上膜非常清楚啦！内参我是250mA,1小时。以前做的实验结果不错的。 2012-12-17 18:39:01
你膜没封闭好，一般来说要室温摇动1-2小时。其实建议4度封闭过夜。

封闭完之后可以洗的，用TBST洗3次，是可以的。如果封闭得好，是不会无端端把封上去的蛋白洗掉的。

我觉得还有个问题是不是你转膜没转好？
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9楼2012-12-16 23:27:18
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
乖乖宝贝: 金币+4, ★★★很有帮助, 谢谢，我今天换封闭液了，实在不行就试试脱脂奶粉！ 2012-12-17 18:39:53
这个样子的一般就是封闭不好了，换封闭液吧，脱脂奶粉吧
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10楼2012-12-17 08:44:32
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