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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » DGGE电泳高手请进，看看这个30%-60%的胶梯度合理不？有图求真相！！！
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binjicn

银虫 (正式写手)

[求助] DGGE电泳高手请进，看看这个30%-60%的胶梯度合理不？有图求真相！！！

做DGGE已经有三个月了，还是没有出成果，万分着急 ，用的是30%-60%的胶梯度，所区分的DNA大约300bp长度，电压设为110v跑了10个小时，就出现了下面结果：



下半部分放大的效果

所有条带集中在胶的下部分，而且条带很密集，请问该怎么优化，是用25-65%的胶，还是35-65%的梯度，还是缩短跑电泳的时间还是减少电压怎么的？？？
由于手机拍摄 不是很清楚  谢谢

[ Last edited by binjicn on 2012-12-14 at 13:08 ]
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1楼 2012-12-14 13:04:56
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wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人认为胶的浓度没有问题，但是你这印染的效果很不好，建议所有的溶液还有电泳缓冲液都采用新配的。另外，可以尝试下75v，16h或是160v，6-7个小时试试。
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2楼2012-12-14 14:12:11
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crystallynn

新虫 (初入文坛)
同命相连啊。。。我的也是，跑DGGE真上火。我的条带也都集中在胶的下半部分，是要调整浓度了。不想做这个啊。。。
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3楼2012-12-16 13:10:50
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whoisthis

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
binjicn: 金币+2, ★有帮助 2012-12-17 18:21:07
1. 引物加夹子

2. 跑个垂直变性胶确定变性剂范围

或者直接调整胶变性剂范围, 集中在胶的下部分的话, 用35-65%, 因为变性剂梯度底部最浓
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4楼2012-12-16 20:01:23
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zqp9110

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
binjicn: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-12-17 18:20:48
GC夹子没问题的话就加大高变性剂浓度。如果是在摸索新条件的话直接用30-70%先试试好了。另外，时间不必这么长吧，我们跑200bp左右的是200V 4h.
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BEYOND
5楼2012-12-17 00:13:14
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binjicn

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zqp9110 at 2012-12-17 00:13:14
GC夹子没问题的话就加大高变性剂浓度。如果是在摸索新条件的话直接用30-70%先试试好了。另外，时间不必这么长吧，我们跑200bp左右的是200V 4h.

en
6楼2012-12-17 18:17:43
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彼岸花开V

至尊木虫 (正式写手)
貌似用SYBR Green I 染的色啊
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7楼2013-08-19 11:02:12
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zhang226296

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zqp9110 at 2012-12-17 00:13:14
GC夹子没问题的话就加大高变性剂浓度。如果是在摸索新条件的话直接用30-70%先试试好了。另外，时间不必这么长吧，我们跑200bp左右的是200V 4h.

求救啊，我做了很久的DGGE了，就是不出结果，8%，50-70%的胶条带全集中在下半部分，上半部分一条都没有，其他的比如40-60%，45-60%，50-65%就跟糟糕，就有几条带，上部还是没有，快崩溃了，有个同学几天就做出来了，求高手赐教啊
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8楼2014-03-21 18:56:16
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zhang226296

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by whoisthis at 2012-12-16 20:01:23
1. 引物加夹子

2. 跑个垂直变性胶确定变性剂范围

或者直接调整胶变性剂范围, 集中在胶的下部分的话, 用35-65%, 因为变性剂梯度底部最浓

求救啊，我做了很久的DGGE了，就是不出结果，8%，50-70%的胶条带全集中在下半部分，上半部分一条都没有，其他的比如40-60%，45-60%，50-65%就跟糟糕，就有几条带，上部还是没有，快崩溃了，有个同学几天就做出来了，求高手赐教啊
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9楼2014-03-21 18:56:29
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zqp9110

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhang226296 at 2014-03-21 18:56:16
求救啊，我做了很久的DGGE了，就是不出结果，8%，50-70%的胶条带全集中在下半部分，上半部分一条都没有，其他的比如40-60%，45-60%，50-65%就跟糟糕，就有几条带，上部还是没有，快崩溃了，有个同学几天就做出来了 ...

这种情况应该是变性条件太低，如果变性剂没有问题的话有可能是体系温度太低，我们用的是60℃。
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BEYOND
10楼2014-03-21 21:16:24
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