24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 2081  |  回复: 21
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

伤何处

木虫 (正式写手)

[求助] 克隆基因,挑克隆拿去测序,好多点突怎么办!?

两个基因都挑了11个送去测序,之前PCR扩增是22个循环扩的,然后连接载体转化。。测序结果显示,每条都有很多点突怎么办?用的是ExTaq酶

[ Last edited by 伤何处 on 2012-12-13 at 21:15 ]
回复此楼
对也罢,错也罢;正也罢,逆也罢;通途也好,崎岖无妨……但问,吾心坚否?若坚,纵使歧路,以铁心,贯穿而过,亦为大道!不坚,便是坦途,也难登临绝顶,观险峰
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangpeng227

木虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by gyesang at 2012-12-14 21:04:53
你的序列有多长,你克隆在什么载体上的,我以前经常这么做来修正基因...

一般基因1000-2000吧,克隆在T vector上,总共在5k左右。
如果用点突变纠正的方法,需要合成引物吧?
要是有2-3个点突变的话,就挺麻烦的。

如果您有什么好方法,还请赐教。
谢谢!
16楼2012-12-15 09:59:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 22 个回答

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主你用的是模板扩增序列然后连接送测序的,
首先,你要保证原始模板没有突变,否则你做PCR时是肯定会有突变的
其次,你需要用高保真的酶,比如pfu, Kod等,楼主的PCR循环控制的很好
祝楼主成功!
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2012-12-13 21:21:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
伤何处: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-12-13 22:04:41
ExTaq不具有校对活性,比较容易出错的。
建议使用高保真酶,如pfu, Pyrobest,phusion等。采用高保真酶,扩增30个循环以内,一般还是可以保证不出错的。
3楼2012-12-13 21:45:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

伤何处

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wangpeng227 at 2012-12-13 21:45:17
ExTaq不具有校对活性,比较容易出错的。
建议使用高保真酶,如pfu, Pyrobest,phusion等。采用高保真酶,扩增30个循环以内,一般还是可以保证不出错的。

我是从cDNA扩增的,直接用pfu可以么?师兄说pfu很难扩出来
对也罢,错也罢;正也罢,逆也罢;通途也好,崎岖无妨……但问,吾心坚否?若坚,纵使歧路,以铁心,贯穿而过,亦为大道!不坚,便是坦途,也难登临绝顶,观险峰
4楼2012-12-13 22:04:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
信息提示
请填处理意见