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lvanmorison

禁虫 (初入文坛)

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分子生化实验经验积累

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忆-雪

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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我也在做细胞的western-blot,我的样品制备是:在细胞培养瓶内养细胞,细胞密度一定要密,然后用遇冷的PBS清晰三遍,使培养瓶中无液体时,用碧云天的裂解液500-400ul/瓶(具体加多少需要预实验确定),进行裂解,至少30分钟,再12000转/分钟,离心10-15分钟,上清液分装,-30或-70保存备用,样品反复冻融后,蛋白降解严重,所以样品制备好后要分装,40-30ul/EP管,够一次用的久可以了,电泳前,已1:1比例加loadingbuffer,混匀后,95度煮沸5分钟就可以上样了!我胶跑的挺好。
另外我想问下你是用传统的方法做western-blot实验,还是用一步法western-blot试剂盒进行实验,我是用后者,说明书是全英文的,我想请教一下你该如何操作?
6楼2012-12-14 18:42:31
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diandong

禁虫 (著名写手)

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2楼2012-12-13 17:49:05
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porphybaby

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励应助和交流! 2012-12-13 21:02:19
必须要先加loading buffer 然后再煮的吧。。。不能直接煮的吧~~~

我一般是先弃去培养基以及死掉的细胞,然后用预冷的PBS洗两遍。再用细胞刮铲刮细胞,收集到EP管中,然后再离心。之后加100 uL裂解液,冰上裂解30分钟,其间隔十分钟就用涡旋剧烈震荡30秒。最后12000转离心 收集上清。

加完loading buffer之后混匀然后再煮5分钟,上样。
3楼2012-12-13 20:41:56
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tinycuke

新虫 (初入文坛)

想问一下,加loading煮5min上样,剩下的下次还可以再用么?如果可以又能放多久呢?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2012-12-14 00:31:00
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