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royalwang铁杆木虫 (著名写手)
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想测一个荧光化合物的激发和发射波长
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| 想测一个荧光化合物的激发和发射波长。我采用固定激发扫发射，然后再固定发射扫激发，来回这样几次，发现发射的波长总是激发波长的2倍，猜测是倍频峰。这样测出来的激发和发射波长，应该不是化合物真实的波长吧。请教各位，应该怎么办！ |
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9楼2012-12-10 14:14:09
feifeitangme
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2楼2012-12-06 20:00:31
【答案】应助回帖
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荧光光度计通常采用光栅来进行波长的准确定位，通过光的衍射和干涉得到明暗条纹，不同波长光的最强衍射花纹出现的位置稍有差别，从而通过光栅把一束混合光按分解成不同波长依次摆列的光带，一般而言，单位长度内，光栅条纹越多，分光效果越好，通过光栅的偏转和出射狭缝的偏移，得到不同波长的光。但是按照光的衍射定律，光在nλ都会发生衍射现象，因此300nm在600nm，900nm出也会发生衍射。 荧光光度计通常使用两组分光器，激发一个，发射一个。并且两束光通常呈90°，测定发射光谱时，激发波长固定，发射光分光器在一定波长范围内偏转得到不同波长的强度，但偏转到激发波长的整数倍时，激发光也能发生衍射现象，即与发射光混合。一般来说，激发光强度很大，而发射光强度较小，因此出现倍频峰。 液体样品的浓度比较大时，对激发光的吸收比较强，且倍频峰处的发射光强度比较大，这是测定的倍频峰不明显，其他时候都需要处理，加滤光片，或者通过数据处理把倍频峰消掉（倍频峰一般是半峰宽较窄的对称峰）。 比如400nm的滤光片应该是400nm长通的滤光片，也就是说400nm以后的光通过，400nm以前的光滤掉了，因此不会滤掉发射峰。 你用300nm激发，在600nm肯定有倍频峰，在900nm会有三倍频，这些倍频峰都可以通过滤光片滤掉。由于这些倍频峰都是因为300nm的激发光引起的，而不是实际存在这样的荧光峰，因此，只需要将300nm的激发光滤去即可消除倍频。 选用滤光片时，应该综合考虑你的激发光和发射光谱的宽度，如果你的发射光谱在400nm的地方已经有峰了，而且400nm的峰对你很重要，那就应该选择更低一点的长通滤光片。 此外，滤光片应该置于发射窗口之前，样品池之后。 |
3楼2012-12-06 20:56:05
royalwang
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4楼2012-12-06 22:58:51
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