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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 外源基因稳转细胞的检测问题
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

[求助] 外源基因稳转细胞的检测问题

最近在做讲外源基因通过一套稳转系统转进细胞中，后期主要就是基因检测，怎样才能确定这个基因外源包装表达合适只是在细胞膜或者细胞内表达呢，之前师姐有做过，基因PCR可以检测到，但是western一直 检测不到，然后我就考虑是否是由于基因在细胞内表达的影响，不能表达在外源或者细胞膜上，所以Western检测不到，做过这方面实验的前辈们可以指教下么？能否有什么方法可以检测该基因表达的定位什么的，然后继续后续的工作

[ Last edited by silicare on 2014-4-26 at 08:25 ]
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1楼 2012-12-04 22:11:26
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myfinalway

木虫 (正式写手)
WB 首先你要保证你的抗体可以与表达蛋白反应
另外如果转染的载体上有标签蛋白，可以用标签抗体来做
如果可以，建议你把GFP蛋白插到你的目的蛋白后面，如果转染成功，开始表达了，可以用荧光显微镜直接观察，不用破坏细胞
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2楼2012-12-08 12:30:59
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 研究室新生 at 2014-04-23 16:57:25
请问楼主，PCR初步检测的话是选择P全长片段吧？我还见过有P抗性基因片段的？不知道哪个更靠谱？

P转基因的全长片段啊，抗性基因不需要P的
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18楼2014-04-25 14:39:27
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 研究室新生 at 2014-04-29 09:17:49
哦，好的啊。。谢谢哎~~那请问这是注册申报材料中必需的检测项和检测方法吗？还有其他检测项吗？...

那我倒不知道啦，我这是做的硕士生实验，没有申报专利呢
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20楼2014-05-05 15:17:27
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普通回帖

刘艳磊

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

看下相应的外源基因的表达产物有没有
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不积跬步，无以至千里
3楼2012-12-08 14:44:21
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 刘艳磊 at 2012-12-08 14:44:21
看下相应的外源基因的表达产物有没有

你是说WB
检测么？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2012-12-08 14:46:22
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

首先确定你的细胞是稳转的不是瞬转的
看你的蛋白是不是有信号肽，有信号肽是外泌的，用软件分析下，是不是跨膜的等
再不确定就取培养上清，细胞裂解物一起做WB,或ELISA 检测都OK.

这些应该在实验开始时就应该计划好的。
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5楼2012-12-08 15:18:09
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by myfinalway at 2012-12-08 12:30:59
WB 首先你要保证你的抗体可以与表达蛋白反应
另外如果转染的载体上有标签蛋白，可以用标签抗体来做
如果可以，建议你把GFP蛋白插到你的目的蛋白后面，如果转染成功，开始表达了，可以用荧光显微镜直接观察，不用破 ...

那蛋白表达的部位如何确定呢？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2012-12-08 16:08:32
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小周 at 2012-12-08 15:18:09
首先确定你的细胞是稳转的不是瞬转的
看你的蛋白是不是有信号肽，有信号肽是外泌的，用软件分析下，是不是跨膜的等
再不确定就取培养上清，细胞裂解物一起做WB,或ELISA 检测都OK.

这些应该在实验开始时就应该计 ...

嗯嗯，之前实验室师姐做过一遍了，但是在在细胞传代的过程中貌似就检测不到了，我是重头再做一遍试试看的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2012-12-08 16:09:58
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myfinalway

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-12-08 16:08:32
那蛋白表达的部位如何确定呢？
...

表达部分也可以分两种方法来确定，最好是两种都有：
1.你的目的蛋白后面带GFP，然后用油镜看荧光，油镜下可以确定蛋白在细胞核还是细胞浆还是膜上
2. 如果WB做得出来了，再用核蛋白、膜蛋白提取试剂盒来提取转染后的细胞蛋白，分别做WB。现在的试剂盒可以分离核蛋白，膜蛋白和胞浆蛋白
这两种方法都做了，是研究比较完整了。
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8楼2012-12-08 19:53:08
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小周

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-12-08 16:09:58
嗯嗯，之前实验室师姐做过一遍了，但是在在细胞传代的过程中貌似就检测不到了，我是重头再做一遍试试看的
...

在传代的过程中外源基因丢失了。你一直加压吧？
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9楼2012-12-08 22:11:49
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 小周 at 2012-12-08 22:11:49
在传代的过程中外源基因丢失了。你一直加压吧？...

没啊，传代时候抗生素减半使用的，选择合适的筛选浓度，在细胞基本上都快死光了的时候就减半抗生素浓度了，然后细胞就会长起来，然后可以扩大培养，培养时也一直是减半的抗生素浓度
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10楼2012-12-09 15:23:26
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