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Jakin_Lau

木虫 (小有名气)

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[交流] 请教微生物菌种保藏低温保护剂的有关问题

最近看外文资料有关微生物低温保护剂的，只是在有关文献有看到，，但是为什么选择那样的低温保护剂或者是哪一类的低温保护剂，原理等还是摸不清头脑，，这里是否有大虾在这个方面有了解的，或者有这方面书籍资料的，就出来冒泡救救这位小虾！！邮箱：Yanqiaoli321@126.com

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1楼 2012-12-03 16:10:22

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dodge1984

铁虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 307672

★
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微生物的冷冻干燥保存所用的保护剂
①酸性物质
天门冬氨酸、谷氨酸、苹果酸、乳酸
②中性物质
葡萄糖、乳糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山梨醇、DL2苏氨酸、肌醇、木糖醇
③碱性物质
精氨酸、组氨酸
④高分子物质及其分解产物
白蛋白、动物胶、粘液蛋白、各种胨、肉汁、酵母汁、可溶性淀粉、糊精、海藻酸、果胶、阿拉伯胶、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 、羧甲基纤维素(CMC) 、藻类
⑤天然的混合物
脱脂乳、血清、脱纤维蛋白血液
⑥其它
抗坏血酸、半胱氨酸、羟胺、胺基脲

（1）甘油：具有良好渗透性的小分子化合物保护剂，能渗透至细胞内部，以羟基和胞内大分子形成氢键，部分取代由水分子形成的氢键，使生物体内的蛋白质、碳水化合物、脂肪和其它大分子物质在缺水条件下仍可保持其原有结构，维持生物体活力。但甘油浓度过高易造成样品发粘，不易干燥。甘油所具有的羟基可与细胞表面自由基联结，避免菌体暴露在介质中，还可与蛋白质形成氢键取代水，保证蛋白质稳定性。甘油有很强持水性，可使细胞在干燥过程中水分不至于下降太快，破坏细胞蛋白质结构而使菌体受损。但甘油浓度提高至一定程度时，对蛋白质稳定作用能力可能达到了极限，过高浓度会使冷冻干燥过程中蛋白质发生变质。冷冻时加入甘油后将发生如下变化: ①冲淡溶液中溶质(盐) 浓度,细胞摄入盐量减少,由保护剂替代; ②保护剂进入细胞,改变了胞内过冷状态,使胞内压力接近胞外压力,降低了细胞脱水皱缩程度和速度; ③保护剂进出细胞容易,缓解了复水时渗透性肿胀引起的损伤。2%，5%，10%，无菌水对照，每种浓度做一组平行取平均值。

（2）蔗糖：非还原性低聚糖，既能起低温保护剂的功能，又能在干燥脱水过程中起脱水保护剂作用。糖生物保护作用机理有“水替代假说”和“玻璃态假说”。在干燥过程中蔗糖形成一种玻璃态,在玻璃态下粘度极高,因而分子扩散系数很低,使大分子物质的链锻运动受阻,细胞壁的通透性降低,从而起到保护作用。生物活性保护剂要有较高的玻璃态温度，或有一定的羟基代替水，使蛋白质保持较低的主相变温度。如工作温度低于保护剂的玻璃化温度，高于被保护的活性物质的主相变温度，该活性物质就能有效保持活性。蔗糖在溶液中易结合水分子，发生水合作用，从而减缓晶核的生长过程，使形成的冰晶较细小，达到保护细胞的目的。蔗糖浓度过高，会使冻结时细胞间歇内的液体逐渐浓缩，从而使电解质的浓度显著增加，产生溶质损伤效应，导致细胞脱水死亡。5%，10%,15%,20%，无菌水对照，每种浓度做一组平行取平均值。

（3）脱脂奶粉：常见的高分子保护剂，溶于水后使溶液呈过冷状态，在冰点以下的相同温度该溶液中的溶质浓度较小，蛋白质盐析变形较小。脱脂奶粉能减少细胞暴露于氧气和介质中的面积，同时在菌体表面形成保护层，减少由于细胞壁损坏而引起的胞内物质泄漏而起保护作用。干燥时，奶粉中的乳清蛋白能在菌体外形成蛋白膜，对细胞加以保护，并可固定冻干酶类，防止由于细胞壁蛋白质损坏而引起的胞内物质泄漏,而且乳中其它成分(如乳糖等) 同样可提高菌体的冻干存活率。脱脂奶粉主要在细胞表面起保护层作用。奶粉中其它成分也可以提高菌体冻干存活率。当脱脂奶粉浓度过高时，菌体表面完全被保护剂覆盖，奶粉中的乳糖会对细胞造成损伤使冻干存活率下降。5%，10%，15%，无菌水对照，每种浓度做一组平行取平均值。

（4）聚合物类：简单小分子经过聚合反应后，形成的巨大分子。聚合物类保护剂的性质：聚合物在冻结过程中优先析出；具有一定的表面活性；提高溶液粘度；显著提高玻璃化转变温度；抑制溶液pH的降低。可以起低温保护剂和脱水保护剂作用。β-环状糊精是一种大分子多糖，具有环状孔洞分子结构，一般为食品添加剂，广泛用于固体饮料制造，既能阻止细胞在干燥时的收缩变硬，提高其外观品质，又能提高产品复水率。5%，10%，15%，20%，无菌水对照，每种浓度做一组平行取平均值。

（5）L-半胱氨酸盐酸盐：抗氧化剂，在冷冻干燥和储藏过程中，细胞内蛋白质可能与空气中的氧发生氧化作用，引起变质，常在冻干样品配方中添加适量抗氧化剂提高稳定性。5%，10%，15%，20%，无菌水对照，每种浓度做一组平行取平均值。

（6）吐温-80：表面活性剂既能在冻结和脱水过程中降低冰-水界面张力所引起的冻结和脱水变性，又能在复水过程中对表面活性剂组分起到润湿剂和重褶皱剂的作用，为常用的非离
子型表面活性剂。5%，10%，15%，20%，无菌水对照，每种浓度做一组平行取平均值。

（7）海藻糖：海藻糖具有特殊的水合作用, 在冷冻干燥生物制品方面具有广阔的应用前景。具有稳定细胞膜和蛋白质结构、抗逆保鲜的作用,在生物保藏方面有着其它保护剂不可比拟的优势,但目前国内尚未工业化大规模生产海藻糖,成本较高。