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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 做信号通路的，是不是要做定位才好！？
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summer2771

木虫 (正式写手)

[求助] 做信号通路的，是不是要做定位才好！？

请问大家，大家一般做通路蛋白，都做了定位嘛？比如免疫荧光！？谢谢！我看很多文章也都只做了蛋白表达，没有做定位的。但是荧光图确实漂亮，感觉能出彩些。不知道通路蛋白是不是这样的？
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1楼2012-11-30 17:03:39
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laoboshihou

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
summer2771: 金币+8, 谢谢您的回帖！ 2012-12-01 01:05:17
summer2771: 金币+8, ★★★★★最佳答案 2012-12-23 02:50:53
通路蛋白通常只做定量，但也有少数做定位的文章，楼主不妨一试。顺便提供一篇范文供楼主参考。

FASEB J. 2009 Aug;23(8):2576-86. Epub 2009 Mar 19.
Cell-type specific activation of p38 and ERK mediates calcitonin gene-related peptide involvement in tolerance to morphine-induced analgesia.
Wang Z, Ma W, Chabot JG, Quirion R.
SourceDouglas Mental Health University Institute, 6875 Blvd. LaSalle, McGill University, Montreal, Quebec, Canada H4H 1R3.

Abstract
Tolerance to morphine-induced analgesia is a well-established phenomenon, often limiting its usefulness in the long-term treatment of pain. The mechanisms underlying tolerance are not well understood. We previously suggested a possible role for spinal calcitonin gene-related peptide (CGRP) in the development of tolerance to morphine-induced analgesia. In the present study, we demonstrate that CGRP is involved in morphine tolerance by differentially regulating the ERK-dependent up-regulation of IL-1beta, TNF-alpha, and microsomal prostaglandin E synthase-1 (mPGES-1) in astrocytes and p38-dependent up-regulation of IL-6 in microglia in the rat spinal cord. A 7-d treatment with morphine induced tolerance to the antinociceptive effect and increased phosphorylated ERK localized in astrocytes and phosphorylated p38 enriched in microglia, both effects being inhibited by blocking CGRP receptors. Interestingly, the inhibition of the ERK pathway suppressed the development of tolerance and morphine-induced up-regulation of IL-1beta, TNF-alpha, and mPGES-1. Blockade of p38 activity also inhibited the development of tolerance and morphine-induced IL-6 up-regulation. Taken together, these data suggest that chronic morphine induces the synthesis of CGRP, which in turn acts on CGRP receptors located on astrocytes and microglia to stimulate ERK and p38, respectively, leading to increased synthesis and release of proinflammatory mediators resulting in tolerance to morphine-induced analgesia.
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2楼2012-11-30 17:12:26
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henryxue

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
summer2771: 金币+4, ★有帮助, 谢谢您的回帖！说的也很详细！ 2012-12-01 01:05:33
免疫荧光并不是不可以作为信号通路说明的方法，但是需要看合不合适。比如你的蛋白会在特定刺激下在胞内聚集、定位到特殊的细胞器、有入核出核的变化，免疫荧光是非常直观的说明手段，但是对于胞浆均匀分布的蛋白、对于衔接蛋白等等，这些用免疫荧光来说明就并不合适。另外，免疫荧光的抗体质量也是决定最后图片漂亮与否的关键因素之一。最后废话一句，实验室里有什么样的试剂、设备以及可行的方法和技术，才是决定你实验设计的关键，如果没有好用的抗体，荧光显微镜也不给力，做免疫荧光反而会画蛇添足。
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summer2771
3楼2012-11-30 22:35:24
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summer2771

木虫 (正式写手)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by henryxue at 2012-11-30 22:35:24
免疫荧光并不是不可以作为信号通路说明的方法，但是需要看合不合适。比如你的蛋白会在特定刺激下在胞内聚集、定位到特殊的细胞器、有入核出核的变化，免疫荧光是非常直观的说明手段，但是对于胞浆均匀分布的蛋白、对 ...

我的理解是免疫荧光主要是用于定位的，我是做骨骼肌的，一整块肌肉剪下来做的WB，没有区分红、白两种肌肉，所以我在考虑是否需要这样做一下，来看看我所研究的通路蛋白到底在哪种肌肉中表达的更高一些
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4楼2012-12-01 01:06:51
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henryxue

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by summer2771 at 2012-12-01 01:06:51
我的理解是免疫荧光主要是用于定位的，我是做骨骼肌的，一整块肌肉剪下来做的WB，没有区分红、白两种肌肉，所以我在考虑是否需要这样做一下，来看看我所研究的通路蛋白到底在哪种肌肉中表达的更高一些...

红白肌肉在形态上或分布上是否能在光镜下明显区分？如果不能的话你在染你的蛋白同时还要加上区分这两种细胞的marker。另外先看看你的抗体的datasheet，看看适用于哪些实验，如果没有标明能做IHC、IF的话要当心抗体的假阴性和假阳性。话说用免疫荧光来定量可能不是很好的手段，亮度的差别可能不会很大的，而且要求定量的话对显微镜的要求是很高的。没有做过肌肉的经验，随意想到的一些东西供参考
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summer2771
5楼2012-12-01 12:06:13
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summer2771

木虫 (正式写手)
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引用回帖:
5楼: Originally posted by henryxue at 2012-12-01 12:06:13
红白肌肉在形态上或分布上是否能在光镜下明显区分？如果不能的话你在染你的蛋白同时还要加上区分这两种细胞的marker。另外先看看你的抗体的datasheet，看看适用于哪些实验，如果没有标明能做IHC、IF的话要当心抗体 ...

谢谢这么详细的回复！
我是做了WB，因为我的WB是没有区分红白肌的，而我做的蛋白在相同的干预下，红白肌内的表达很可能是不一样的，所以想看看是否存在在某一种肌肉类型中表达更高的问题！
我买的是CST做WB的抗体，但是有的当时也选择了可以做免疫荧光的。有个老师说用两部法就可以做，无所谓一抗是否能特异性的做免疫荧光。
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6楼2012-12-01 19:08:41
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