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贝壳v下了

铜虫 (初入文坛)

[求助] pcr的温度及时间的选择

各位大侠,水稻叶片的DNA做pcr的一些问题。我的片段长度是600至800bp的样子   1、请问变性温度,退火温度,延伸温度是多少 ?  2、请问变性时间,退火时间,延伸时间是多久?  3、请问应跑多少个循环比较合适,还有第一个步骤的温度和时间是怎样的,以及最后一个步骤的温度及时间是怎样的  4、在跑电泳时电压,电流,功率,及时间怎样才合适,我跑的是聚丙烯酰胺凝胶电泳。
望请各位大侠多多指教,感激不尽。
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专心科研
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
……变性温度一般94或者95,退火这个没办法回答你,看你的引物,延伸温度72,相关的时间你随便找一篇文献都有吧…………冒昧的说,我觉得你问的这些东西随便搜搜就有了……
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
2楼2012-11-30 09:49:17
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czdaeq

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的问题太多了
这到底是你的实验,还是俺们的实验?!
我这先回答你第一个问题:
变性温度一般是95°-98°(查生化书、基因工程操作原理等书可知);退火温度、延生温度,看你用的酶的说明书,可知。
3楼2012-11-30 10:20:38
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q317476148

铁杆木虫 (著名写手)

喵星人

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
退火温度得看 引物上面的Tm-5度,一般都是25到40个循环
4楼2012-11-30 10:25:08
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wangqi20092

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
变性和延伸温度都可以固定用,分别是94和72。退火温度根据你引物的情况确定的。跑胶的设定参考文献都有,自己可以查到。自己先搜一下还是应该的,呵呵呵。
5楼2012-11-30 10:35:45
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贝壳v下了

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by wangqi20092 at 2012-11-30 10:35:45
变性和延伸温度都可以固定用,分别是94和72。退火温度根据你引物的情况确定的。跑胶的设定参考文献都有,自己可以查到。自己先搜一下还是应该的,呵呵呵。

好的,谢谢啊,我找找看看
专心科研
6楼2012-11-30 20:37:58
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z25935475

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
看看你的酶1min能延伸多少bp 设置相应的延伸时间就行了,说明书上都有,看看你的buffer 是 mg plus 还是free的 如果是free的一般都会有氯化镁附带的,看看你要的浓度
7楼2012-12-01 00:14:37
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贝壳v下了

铜虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
\(^o^)/~,我都不知道怎么才能知道我的酶1min能延伸多少bp,呵呵太水啦。
专心科研
8楼2012-12-01 08:20:51
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gongzifan812

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一般都是要看你的酶 的说明书,现在国内试剂公司都在说明书里注明了温度,对应1Kb的延伸时间,不一样的酶自然就不一样
9楼2013-02-19 00:02:00
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