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sanbanwu

新虫 (初入文坛)

[求助] 酵母双杂mating后显色问题已有2人参与

大家好,这半年一直在做酵母双杂,真是纠结啊,前几天终于可以mating 了,四缺板子上长得菌有160多个,将它们转接到涂x-gal的板子后,3天了,菌长得都很好,但是没有一个显蓝色,这是为什么啊,难道都是假阳性的?有谁做过这个的帮帮忙。。。
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向日葵的足迹

铜虫 (初入文坛)

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感谢参与,应助指数 +1
显不显蓝色和互作与否没有关系吧?
2楼2012-11-29 19:54:34
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chong889988

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2012-12-22 19:01:54
一 可能两个蛋白真的不相互作用 二  涂布了X-GAL的四缺板放置于光下常温过久失效  三 RNA提取不好问题反转录后没有产生你需要的片段  当然还有其他很多原因的  我以前做了14个基因的cDNA作为诱饵 只有两个出现蓝色平板
3楼2012-11-30 17:03:24
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sanbanwu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by chong889988 at 2012-11-30 17:03:24
一 可能两个蛋白真的不相互作用 二  涂布了X-GAL的四缺板放置于光下常温过久失效  三 RNA提取不好问题反转录后没有产生你需要的片段  当然还有其他很多原因的  我以前做了14个基因的cDNA作为诱饵 只有两个出现蓝色平 ...

在划线的时候,大概用了差不多两个小时,难道真的是x-gal见光失效了?
4楼2012-12-02 14:13:47
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chong889988

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by sanbanwu at 2012-12-02 14:13:47
在划线的时候,大概用了差不多两个小时,难道真的是x-gal见光失效了?...

两个小时应该没问题,存放的时候在-20度就ok,还有配置没问题的话, 你可以PCR验证下你的诱饵基因是否还在酵母菌中AH109中的BD载体上。文库酵母菌是否存在cDNA判断,如果上述几步没问题,我想应该是这两个蛋白真的不相互作用。
5楼2012-12-22 09:08:43
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suanzhaner

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

直接涂板看蓝白斑的应该用X-a-gal,beta-半乳糖苷酶不分泌,必须裂解酵母才能进行x-gal的蓝白斑筛选。
6楼2014-03-11 19:10:26
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GAATTC

新虫 (初入文坛)

你好!
    我刚开始准备,想请教你几个问题,你是从文库中筛选的吗?那你的文库是以Y187酵母菌的形式保存的吗?你做杂交的步骤是和Clontech的说明一样吗?听说抗生素AbA的浓度不好控制,你是怎样做的?
谢谢
7楼2015-09-24 10:14:34
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qjf117

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by chong889988 at 2012-12-22 09:08:43
两个小时应该没问题,存放的时候在-20度就ok,还有配置没问题的话, 你可以PCR验证下你的诱饵基因是否还在酵母菌中AH109中的BD载体上。文库酵母菌是否存在cDNA判断,如果上述几步没问题,我想应该是这两个蛋白真的 ...

若四缺板上,能长 白色菌落,是不是说明互作比较弱而已? 不是说强的互作可以激活4个报告基因,而显色只是其中一个吗?
8楼2018-12-26 13:47:46
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匿名

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9楼2018-12-28 17:26:12
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