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yuminzorro

木虫 (小有名气)

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[求助] 一个平板上挑取不同菌落得到的测序结果不一样

做克隆测序时，我将PCR产物切胶回收，连接转化到感受态细胞中，进行蓝白斑筛选后，一个平板上挑去3个单克隆，菌液PCR结果显示是阳性克隆，然后将菌液送去测序，但测序结果3个中只有一个是我的目的序列。求高手帮助解释一下！谢谢！

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1楼2012-11-14 14:39:46

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sxxuan

金虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

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yuminzorro: 金币+5 2012-11-16 11:27:57

PCR很容易出现假阳性，环境中的PCR产物污染。还有平板中残留的污染，理论上宿主细胞会分泌核酸酶把外来的片段都消化掉，所以哪怕有连接产物没有成功转入宿主细胞，最后都会被降解掉。但我个人觉得这只是理论，实际上有没有残留也是很难讲的。
PCR过程中所产生的序列，并不一定都是完全扩增出目的序列，可能只是部分序列并不完整，但仍在引物检测范围内。如果转化后挑菌是阳性就肯定是都是目的序列，测序公司就赚少很多钱了。
避免假阳性的比较好的方面是利用载体上的引物和目的序列的引物进行PCR验证，如果只是一两个克隆就觉得无所谓，如果做很多克隆的话，每次验证都要换一条引物还有优化体系的话，是很麻烦的事情。
如果你的引物本身没有酶切位点的话，可以用载体上的酶切位点试试。PCR加上酶切加上测序，才是最可靠的。good luck