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用试剂盒检测奶粉中的叶酸
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| 各位大侠，请问下有谁使用过拜发试剂盒微生物法（96孔板）检测奶粉中的叶酸，我们在使用的过程中重复性不好，在奶粉的前处理和使用酶标仪测定菌的浓度时标准曲线由于菌液的不均匀不断变化，导致待测样的浓度也会出现变化，具体应该有个什么样的标准呢？谢谢！ |
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lichao5263
铁杆木虫 (著名写手)
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【答案】应助回帖
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VitaFast® Folic Acid 简介 VitaFast® Folic Acid试剂盒简单易用，采用微生物方法，在微孔板中定量检测食品、药品和饲料中的叶酸总量（包括添加和原生叶酸）。所有所需的试剂均包含在试剂盒中。本试剂盒共能提供96次检测（包括标准品）。最后使用ELISA reader (610 - 630 nm 或者540 - 550 nm)进行读数。 含添加叶酸的样品处理： 液态样品：无菌过滤和稀释 固态样品：均质、提取（离心）、无菌过滤和稀释 含原生叶酸的样品处理： 固态样品：均质、酶化处理、提取、（离心）、无菌过滤和稀释 所需时间：试验过程…………………….约10分钟 计算………………………….2分钟 孵育： 黑暗、37 °C条件下44－48小时 标准范围：0.16 - 1.28 μg / 100 g (ml) 回收率： 90 - 105 % Intra-assay CV for standards: < 10 % Inter-assay CV for standards: < 10 % 1． 产品用途 VitaFast® Folic Acid微孔板检测试剂盒是利用微生物方法，用于定量检测食品、药品和饲料中的叶酸总量（包括添加和原生叶酸）。本微生物检测系统符合EN14131标准。 2． 检测原理 叶酸是从样品稀释提取所获得的。将稀释了的提取物和叶酸检测培养基加入包被有鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus (ATCC Nr. 7469)的微孔中。Lactobacillus rhamnosus的生长状况取决于叶酸的含量。添加叶酸作为标准或者作为样品混合物，细菌会一直生长直至叶酸被消耗殆尽。孵育条件应为黑暗、37 °C条件下孵育44-48小时。细菌生长时新陈代谢的强度和叶酸的含量形成关系并可以绘制称标准曲线，最后通过ELISA reader在610 - 630 nm (或者540 - 550 nm)读取结果。 3. 检测说明 水质在整个测试过程中起着十分重要的作用。本试剂盒中带有作为溶剂的无菌蒸馏水，用于重组、稀释标准品和样品的提取。附加的蒸馏水在以上过程中都是必不可少的。 要求整个检测过程中保持无菌操作。所使用的玻璃器皿保证无化学残留物、清洁剂、化学物质和微生物污染。因此，玻璃器皿使用前先用3 mol / l的盐酸漂洗，然后再用蒸馏水250 °C (482 °F)条件下加热1小时。在使用前回至室温。 样品制备和提取可以不用在无菌条件下进行。样品的过滤、稀释与检测前的准备工作则与整个检测过程一样必须在无菌条件下进行。 检测的每一个步骤都需要校正。标准品和样品应该进行3次检测（注意：官方标准中推荐3次检测方法）。未知样品应该用2份提取物的稀释液检测（误差应该小于10%）。如果在更高的稀释液中叶酸含量更多，则可能含抑制剂，比如重金属或者抗生素。 4. 提供试剂 每个试剂盒中包含： 1 x 96孔微孔板，包被有 Lactobacillus rhamnosus (ATCC Nr. 7469) 3 x 无菌蒸馏水 (30 ml) ，用于准备培养基、标准品和样品提取稀释液 3 x 叶酸培养基 (固体) 3 x 叶酸标准品 (固体) 3 x 叶酸缓冲液 (液体) 3 x 粘性箔 1 x 微孔板固定器 5. 需要试剂但试剂盒种不提供 −黑暗条件下的培养箱，37 °C (98.6 °F) −90 -100 °C (194 - 212 °F)水浴，或者高压灭菌锅 −ELISA reader 610 - 630 nm (540 - 550 nm) −pH 测量仪 −离心机，大约10000 x g −刻度移液枪 20 - 200 μl; 100 - 1000 μl −灭菌微量移液枪 tips 20 - 200 μl and 100 - 1000 μl −无菌烧瓶 1.5 - 2.0 ml −移液枪 5 or 10 ml −带帽的无菌离心机管 (15 and 50 ml) −带无菌注射器的0.2um无菌滤膜 −双蒸水用于样品提取(available at ifp) −浓缩NaOH −1 mol / l NaOH (0.4 g 溶解于100 ml水中) 检测原生叶酸所需试剂 −胰液素(Sigma P1750) −磷酸(盐)缓冲液(0.5 mol / ；0.1 % 抗坏血酸盐)：溶解于1升水 7.8 g脱氢磷酸钠二水化合物和1 g 抗坏血酸钠, 校正pH值至7.2 6．用户须知 −检测培养基有可能刺激眼睛、皮肤和隔膜 −完成试验后须根据规章处理检测仪器（如使用高压灭菌锅） 7．贮藏条件 试剂盒应存放在2－8℃条件下 处理过的试剂（标准品、培养基）和叶酸缓冲液应马上使用，并在检测后丢弃 将未使用的微孔板条放回原来的箔袋中，并与干燥剂一起重新封好，放在2－8℃温度下。微孔板须防止受潮或受到其他污染。 请勿在试剂盒标注的有效期之后使用。 8．试剂失效的迹象 空白的吸光度值大于标准品1 最高浓度标准品的吸光度值小于0.6（630nm） 9．样品处理 样品必须储存在4℃、避光条件下。 检测富集营养样品中的游离叶酸时，热水提取方法通常就足够了。但是富集营养的饮料可以在过滤之后直接使用。由于使用热水提取，所以原生叶酸只能被部分检测。对于检测原生V B12总量，样品应进行缓冲和用酶水化处理。 样品提取时需要1g或1ml样品溶解于40ml双蒸水或提取溶液中。相当于样品的稀释倍数为40，这个稀释倍数已经包括在标准曲线中。 样品提取后需要进一步稀释。稀释倍数取决于由标准曲线中间部分显示的标准浓度，它由期望的成分除以标准曲线中间区域所显示的标准品浓度获得（详见产品标签或认证，每100g或100ml浓度）。至于涉及到胶囊或药片时，浓度时常表达为“/片胶囊”，此时浓度必须转化成“/100g”（详见11.的计算示例）。这个稀释倍数在计算结果的时候必须考虑。 样品提取时使用无菌滤膜（0.2μm）进行过滤，此时。如果由于固体颗粒或者浑浊导致过滤不顺利，则在无菌过滤之前应先离心（至少在8000g的离心力下离心5分钟）。 样品提取液可以在提取当天使用，使用之前应避光保存。提取稀释液应马上使用。 9.1.液体样品（富含维生素的果汁、健康饮品） 加入1ml样品至50ml无菌离心管中，准确加入双蒸水至40ml，摇匀。使用无菌0.2μm滤纸过滤1.0～1.5ml样品到一个无菌试管中。是否进一步稀释则取决于浓度范围（详见计算示例中的稀释倍数）。 9.2.含维生素的可溶固体样品（粉末、药片） 称取1g样品至50ml无菌试管，用双蒸水准确加至30ml刻度。摇匀至样品溶解。用NaOH调整pH值至7.0～7.5。然后加无菌水精确至40ml。用0.2μm无菌滤纸过滤1.0～1.5ml样品至一无菌试管中。是否进一步稀释则取决于浓度范围（详见计算示例中的稀释倍数）。 9.3.维生素胶囊、药片 首先胶囊或药片的重量必须确定（平均5～10个胶囊或药片）。药片用研钵或搅拌机均质，胶囊须切开并取出其中的颗粒进行试验。 称取1g药片或切开1个胶囊至一个50ml无菌离心管中，用双蒸水加至30ml，摇匀。用NaOH调整pH值至7.0～7.5。然后加无菌水精确至40ml。在90～100℃水浴中提取30分钟。在提取时试管须振荡至少5次。当然期间必须保证试管是否充分封闭。迅速降温至30℃以下。使用0.2μm无菌滤膜过滤1.0～1.5ml样品至一个无菌试管中。是否进一步稀释则取决于浓度范围（详见计算示例中的稀释倍数）。 9.4富含维生素的谷物、婴儿食品、面包、面粉和食品添加剂 称量1g均质过的样品至一个50ml无菌试管中，加入双蒸水至30ml，充分摇匀。用氢氧化钠溶液调整其pH值至7.0-7.5，用双蒸水加至40ml在90～100℃水浴中提取30分钟。在提取时试管须振荡至少5次。迅速冷却至室温。使用0.2μm无菌滤纸过滤1.0～1.5ml样品至一个无菌试管中并进行进一步稀释。 9.5.原生叶酸 提取复合物时，检测含原生叶酸的样品必须先经过酶化处理。以下检测过程已经开始在检测牛奶时使用。 称取1g均质过的样品至一个50ml无菌离心管中，用磷酸盐缓冲液加至40ml（0.05mol/l；0.1％抗坏血酸盐；pH7.2）。之后在90～100℃水浴中提取30分钟。在提取时试管须振荡至少5次。冷却至室温，加入10mg干胰液素。旋紧管盖，摇匀，在37℃条件下培养24小时。随后在90～100℃水浴中提取30分钟。迅速冷却至室温。使用0.2μm无菌滤纸过滤1.0～1.5ml样品至一个无菌试管中。是否进一步稀释则取决于浓度范围（详见计算示例中的稀释倍数）。 10.检测过程 10.1.准备 装有无菌水的瓶子：推开蓝色帽，沿着玻璃边缘垂直向上拉开，丢弃。 叶酸培养基：足够进行至少6条微孔板试验，培养基必须在试验之前新鲜制备。打开瓶盖用镊子从干燥剂中取出培养基，丢掉干燥剂。 －加入10ml无菌水（取自试剂盒中）至叶酸培养基中。 －加入1ml叶酸缓冲液至培养基中。 －盖好培养基瓶，摇匀。 －在90～100℃水浴中加热至少5分钟，期间振荡至少2次；期间保证瓶子封闭。 －迅速冷却至室温（低于30℃）。 －使用0.2μm无菌滤纸过滤培养基至15ml无菌离心管中。 每个叶酸标准品都足够进行至少3个孔的试验。标准品必须在试验之前新鲜制备。 －打开维生素B12标准品瓶，取出盖子。丢掉盖子和红色塞子 －加入x ml（x＝详见质量保证书）无菌水（取自试剂盒）至标准品瓶中。用移液管溶解标准品：用标准品瓶中的水冲洗移液管尖数次＝标准品浓缩液。 －取6个无菌管（1.5～2.0ml）并按照下列表格准备标准品溶液。 标准曲线 μg/100g(ml) 无菌水 μl 标准浓缩液 μl 总体积 μl 空白：0 900 ＋ 0 ＝ 900 标准品1：0.16 900 ＋ 100 ＝ 1000 标准品2：0.32 400 ＋ 100 ＝ 500 标准品3：0.64 300 ＋ 200 ＝ 500 标准品4：0.96 200 ＋ 300 ＝ 500 标准品5：1.28 100 ＋ 400 ＝ 500 10.2.检测过程 －用移液管吸取150μl叶酸培养基至微孔中 －用移液管吸取150μl标准品或样品至指定的微孔中（用标准品或样品溶液冲洗移液管尖） －用粘合箔盖住微孔条或微孔：除去粘合箔上的保护层，将其平放在微孔条上，用手或压舌板将粘合箔平压，使其充分封闭微孔板条。 注意：保证粘合箔和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘部分 －在37℃黑暗条件下（可用孵育器）孵育44～48小时 10.3.测量 －再次向下挤压粘合箔，将微孔板向上放置在桌面上，在桌面平面上振荡，使微生物溶解在培养基中 －对角揭去粘合箔，从左边开始进行 －破坏微孔液体表面所有的泡沫（可以用移液管尖去除） －用ELISA reader 610～630nm（或540～550nm）条件下读取浑浊度 注意： －当孵育44～48小时后，微孔板能在冰箱里最多储存48小时，因此必须在这个时间段内测量混浊度 －为了避免由于假期或周末所产生的时间上的损失，微孔板能在60小时之后进行评估计算。推荐使用定时器在48小时之后关闭孵育器。 11.计算 推荐在计算结果时使用必发公司提供的配套软件。 样品稀释倍数40已经包括在标准曲线中（详见质量保证书）。在下面的公式中，只需要考虑提取的进一步稀释倍数和不同的样品重量。 液体样品（富含维生素的果汁、健康饮品） 从标准曲线上读取的浓度×稀释倍数 叶酸 ＝ ──────────────────── （μg/100ml） 样品总量（ml） 固体样品（谷物、婴儿食品、面粉、面包、添加物） 从标准曲线上读取的浓度×稀释倍数 叶酸 ＝ ──────────────────── （μg/100g） 样品总量（g） 胶囊或药片 从标准曲线上读取的浓度×稀释倍数 叶酸 ＝ ──────────────────── （μg/100g） 样品总量（g） 从标准曲线上读取的浓度×药片重量（g）×稀释倍数 叶酸＝ ────────────────────────── （μg/药片） 100×样品总量（g） 样品提取的稀释倍数计算示例 例a： 固体样品，标注浓度125μg / 100g 提取液稀释应在标准曲线中间区域。因此，浓度应除以标准2 计算： 1.2 μg ÷ 0.32 μg ＝390 → 结果为稀释倍数大约为400 → 1 ：400 稀释 1 ： 400 1 ： 10（0.1 ml ＋ 0.9 ml）， 1 ： 10（0.1 ml ＋ 0.9 ml）， 1 ：4（0.25 ml ＋ 0.75 ml） 例b： 药片，标注浓度100μg / 片 计算： 100 μg / 片，平均重量1g ＝ 10000μg / 100g 10000 μg ÷ 0.32 μg ＝31250 →结果为稀释倍数大约为30000 →1 ：30000稀释 1 ：30000 1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml），1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml） 1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml），1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml）， 1 ：3（0.2 ml ＋ 0.4 ml） |
3楼2012-11-20 01:42:23
lichao5263
铁杆木虫 (著名写手)
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【答案】应助回帖
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搜到的一篇文献，用的不同方法，自己慢慢看吧！6个金币，真小气 Determination of folic acid in milk.pdf(133.14KB) http://kuai.xunlei.com/d/GLHWAFWYOIDQ?p=130497 |
2楼2012-11-20 01:33:02
kenyang214
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