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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 外源基因连接载体
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caidongjie

银虫 (初入文坛)

[交流] 外源基因连接载体

请教各位大侠：为什么我连接以后的重组载体质粒PCR有目的条带，但是酶切后什么条带都没有，质粒跑电泳也没有条带，做PCR时用的是一个重组质粒，我的酶切位点是Hind3和Xba1，表达载体是pMG36e。。。。。求助各位大侠们。。。。。
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1楼 2012-11-09 17:29:14
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竹子小小

木虫 (小有名气)
★
caidongjie(金币+5): 谢谢参与
质粒跑电泳都没有带那就是你质粒没提出来
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caidongjie
2楼2012-11-09 17:44:54
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liuan6126

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
质粒的浓度太低了，重新提，菌体量大点
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caidongjie
7楼2012-11-11 11:22:28
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caidongjie

银虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 竹子小小 at 2012-11-09 17:44:54
质粒跑电泳都没有带那就是你质粒没提出来

谢谢，我用8微升的质粒跑的电泳，可能浓度太低了，PCR只用2微升但是条带很亮，郁闷
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8楼2012-11-11 18:54:56
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caidongjie

银虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by liuan6126 at 2012-11-11 11:22:28
质粒的浓度太低了，重新提，菌体量大点

谢谢，我平时用5毫升菌液提的，还需要增加菌体量吗？增加多少
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9楼2012-11-11 18:55:55
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-14 16:38:13
PCR会存在假阳性的现象，一般不太可靠。最好的方法就是，先提取质粒，电泳，看下大小是否是正确的，大小正确之后，选择合适位点进行酶切验证，酶切后得到的片段大小与预测大小正确后，最好送去测序公司测下序，从而可以判断重组载体是否建立成功
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10楼2012-11-12 19:07:13
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jl860822

金虫 (正式写手)
质粒有问题！！
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11楼2012-11-12 20:37:53
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caidongjie

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by apple6299 at 2012-11-12 19:07:13
PCR会存在假阳性的现象，一般不太可靠。最好的方法就是，先提取质粒，电泳，看下大小是否是正确的，大小正确之后，选择合适位点进行酶切验证，酶切后得到的片段大小与预测大小正确后，最好送去测序公司测下序，从而 ...

谢谢您！我提质粒跑电泳没有条带啊，酶切的时候什么条带都没有，是质粒浓度低吗？
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12楼2012-11-12 20:45:39
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liuan6126

铁杆木虫 (正式写手)
★
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9楼: Originally posted by caidongjie at 2012-11-11 18:55:55
谢谢，我平时用5毫升菌液提的，还需要增加菌体量吗？增加多少...

这个5 ml也不大好讲，毕竟OD600可能不同，现在你PCR出来，但质粒酶切没条带，估计你提完质粒没跑电泳看看浓度。
建议：菌体量大点，提完质粒3 ul电泳看看浓度。PS：冬天有些时候质粒提不出来，建议第二步裂解在37°水浴里3min.
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13楼2012-11-13 13:57:27
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smdsfy

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-14 16:38:29
PCR验证要阳性对照和阴性对照，最好是做双酶切，首先你的质粒没提出来，是不是菌的问题，或是哪个试剂 的问题，把你以前做成功的质粒一起做，做个阳性对照，这样能找出问题在哪
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14楼2012-11-13 14:26:29
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caidongjie

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by smdsfy at 2012-11-13 14:26:29
PCR验证要阳性对照和阴性对照，最好是做双酶切，首先你的质粒没提出来，是不是菌的问题，或是哪个试剂 的问题，把你以前做成功的质粒一起做，做个阳性对照，这样能找出问题在哪

恩恩谢谢这些我都在考虑，慢慢排查吧，这个质粒也确实难做啊
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15楼2012-11-14 09:28:45
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caidongjie

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by liuan6126 at 2012-11-13 13:57:27
这个5 ml也不大好讲，毕竟OD600可能不同，现在你PCR出来，但质粒酶切没条带，估计你提完质粒没跑电泳看看浓度。
建议：菌体量大点，提完质粒3 ul电泳看看浓度。PS：冬天有些时候质粒提不出来，建议第二步裂解在37 ...

恩恩，十分感谢，我再试试看，不行就得重头做了，脑袋都大了
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16楼2012-11-14 09:30:59
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qi_yongbin

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-14 16:38:42
做克隆遇到这种问题很正常，PCR验证一般来说还是可以的，但是你一定要设置阴性和阳性两个对照，不知道的你的载体有多大？酶切的目的条带有多大？如果是小片段，酶切后电泳也很难看到，建议直接送测序再说！
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17楼2012-11-14 10:26:03
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Marado

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-11-14 16:38:52
不知道为嘛很多人都不喜欢用酶切去验证，PCR验证是个假阳性概率挺高的方法，只能作为初步筛选疑似阳性菌株，不能作为确定手段.
你这个明显是质粒没有提取成功，按道理5ml的菌液提取出的质粒量很足的，只要菌液不是太稀，点个5ul应该就可以看得很清晰，你还是先从质粒提取上找原因吧，质粒提取电泳都没条带……还做什么酶切呢？
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18楼2012-11-14 15:03:37
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ph031810213楼
2012-11-09 18:18   回复  
caidongjie(金币+5): 谢谢参与
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7792675374楼
2012-11-09 18:19   回复  
caidongjie(金币+5): 谢谢参与
张咖喱5楼
2012-11-09 18:29   回复  
caidongjie(金币+5): 谢谢参与
advancelove6楼
2012-11-09 19:30   回复  
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