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jhonsmith001金虫 (小有名气)
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[求助]
询问融合PCR反应体系和条件
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| 哪位高手能帮我下：如果想将两个400bp和一个5000bp的片段通过融合PCR连接起来，两个短片段和一个长片段的加入量一般怎么算的呢？还有看有些讨论说用两步PCR反应，即加引物和不加引物反应，那这两个PCR条件怎么设计呢？我的这三个片段的连接部位有20bp。非常感谢高手们能帮我解决这个头疼问题！ |
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jhonsmith001
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3楼2013-01-15 11:36:30
我是传奇456
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【答案】应助回帖
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1.长片段和短片段的量都一样； 2.PCR反应都必须加入引物，你的意思是有些人说第一步可不加两端的引物吧？ 3.PCR条件注意好退火温度即可。第一步根据各片段不同用不同条件，成功P出重叠部分，不过此步一定得用Pfu酶；第二步就直接用两端引物，根据三个片段大小以及Taq酶的合成速率来设计延伸时间。 |
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2楼2013-01-07 16:38:15
