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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为什么RNA总是降解！
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看天

木虫 (知名作家)

[求助] 为什么RNA总是降解！

要做转录组分析，需要制备样品送到芯片分析公司让他们提取RNA做转录组分析，但是样品我准备2次了，邮寄到他们那边提出RNA后给出质检结果都是降解了，郁闷！
我的样品制备过程如下：
（1）在设计的时间点取样
（2）预冷水中超声清洗90s（我做的是吸附固定化，一般都是超声清洗下来，整个反应体系6ml连小瓶子都放进去了）
（3）取1ml菌液于1.5ml离心管中12000rpm离心1min,弃上清后再加入1ml离心2min。
（4）弃上清后加入1.2ml Trizol,用枪悬浮充分。
（5）液氮速冻2min.
（6）立即-80保存。
（7）2天后带干冰邮寄到公司。
（8）他们负责RNA的提取。
（9）5天后给出质检结果全部样品降解（RIN在4.5-6之间；28s/18s在0.1-0.4之间）

前后两次了发来质检结果都是降解，不知道到底是我的样品准备过程有问题还是其他问题？
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
1楼 2012-10-24 20:37:09
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

匿名

用户注销 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
看天: 金币+3, 好的注意了 2012-11-09 12:46:41
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-09 14:20:42
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39楼2012-11-09 10:55:08
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看天

木虫 (知名作家)
来人回答啊
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2楼2012-10-25 10:08:01
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-10-25 12:13:42
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-10-26 08:06:33
1、细菌RNA的抽提并不困难，可以跟公司谈一下，你准备洗脱下来的活菌，除了超声破碎还有其他办法吗？
2、尽量用对数生长期后期的菌液。
3、超声破碎细菌之后，若不立刻处理，RNA严重降解，这点我试验过好几次，Rnase确实管用。
4、还是推荐送活菌由公司来处理比较合适。当然了，公司把你的样品如何存放的？若加入了足够提取剂，一般4℃一周问题不大。
5、把你处理后的样品自己小提一下，也同时提取一份活菌的，验证看看。

祝福好运哈！
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3楼2012-10-25 11:01:25
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看天

木虫 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhwenxing at 2012-10-25 11:01:25
1、细菌RNA的抽提并不困难，可以跟公司谈一下，你准备洗脱下来的活菌，除了超声破碎还有其他办法吗？
2、尽量用对数生长期后期的菌液。
3、超声破碎细菌之后，若不立刻处理，RNA严重降解，这点我试验过好几次，Rn ...

(1)我只是超声清洗90s，不是超声破碎。
（2）实验设计的不同时间点的样，所以不能单取对数生长期后期
（3）我其实就是相当于吧 发酵液离心后搜集菌体加TRIZOL后送到公司的。
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4楼2012-10-25 12:16:06
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看天

木虫 (知名作家)
回答我啊
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5楼2012-10-25 18:29:16
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 多谢啊 2012-10-25 21:09:59
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-10-26 08:06:47
楼主你也得看看公司那边怎么处理你的菌体的~看样子你是把菌体超声清洗就完了，菌体是没有破裂的~那么也就是要在公司那边将楼主泡在trizol里面的菌体破碎再处理。假如公司没有把菌体破裂开的话，那肯定提出来是降解的样子……
比如以前我提取的时候是柱子混着菌体以及trizol用机器打，抽出来常降解。后来咬咬牙用液氮磨，就再也没问题了……
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6楼2012-10-25 20:10:12
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看天

木虫 (知名作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-10-25 20:10:12
楼主你也得看看公司那边怎么处理你的菌体的~看样子你是把菌体超声清洗就完了，菌体是没有破裂的~那么也就是要在公司那边将楼主泡在trizol里面的菌体破碎再处理。假如公司没有把菌体破裂开的话，那肯定提出来是降解的 ...

是啊 我也不知道是我的准备过程有问题还是他们提取有问题；按理说这么一个生物芯片的公司 他们操作总是规范的 不应该出问题的
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7楼2012-10-25 21:11:02
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 看天 at 2012-10-25 21:11:02
是啊 我也不知道是我的准备过程有问题还是他们提取有问题；按理说这么一个生物芯片的公司 他们操作总是规范的 不应该出问题的...

先问问那边的处理方法呗~看看方法是否科学~
那楼主你是什么样品啊放线菌？真菌？感觉是挺难处理的样品呢~
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8楼2012-10-26 08:00:39
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luckydog52

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们实验室是用液氮磨碎之后提的RNA送去做转录组的
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自信源于一次次成功的积累
9楼2012-10-26 09:21:11
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看天

木虫 (知名作家)
引用回帖:
8楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-10-26 08:00:39
先问问那边的处理方法呗~看看方法是否科学~
那楼主你是什么样品啊放线菌？真菌？感觉是挺难处理的样品呢~...

是细菌 为梭菌 clostridium
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10楼2012-10-26 09:33:19
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