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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 酶的分离纯化
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zhangpamela

木虫 (小有名气)

[求助] 酶的分离纯化

我要纯化一种从细菌提取出来的未知粗酶，盐析后上离子交换，等电点未知，我准备选用DEAE-sephroseFF 填料试一试，但不知道选什么缓冲液，pH调为多少？不知道这种填料合适不？100ml的填料能用几次？还挺贵的，一般这种未知的是首选阴离子呢还是阳离子？
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1楼 2012-10-17 18:44:23
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先做粗酶液pH稳定性的实验，确定了稳定范围之后再选择层析柱。
Effect of pH and temperature on glucoamylase activity and stability
The effect of pH on glucoamylase activity is measuring glucoamylase activity at different pH value of pH 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 at 37ºC. The effect of temperature on glucoamylase activity is measuring glucoamylase activity at different temperature of 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 and 60ºC at optimum pH.
  The effect of pH on glucoamylase stability was conducted by mixing 0.1mL enzyme with 0.9mL 0.1M buffer in different pH value (The buffers used were: citrate-phosphate buffer, pH 3.0–7.0; sodium-phosphate buffer, pH 6.0–8.0; Tris-HCl buffer, pH 7.0–9.0; and glycine-NaOH buffer, pH 8.5–12.0). The mixtures were incubated at 4ºCfor 24h, and the residue enzyme activity were measured. The effect of temperature on enzyme stability was conducted by incubating enzyme at 30, 35, 40, 45, and 50ºC for 1 h, and the residue enzyme activity were measured.
Each result of the character assay was showed by a scatter diagram with trend line, the highest activity was defined as 100%, other activity was defined as relative activity. The error bars represent the standard deviation of triplicate measurements.
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
3楼2012-10-20 15:42:34
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
scelab: 金币+5, MicEPI+1, good 2012-10-20 17:16:48
zhangpamela: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-11-26 16:18:50
该酶的其他性质知道吗？
选择离子交换一般需要注意几个问题：
1. 电导，即盐浓度。本例中，你的样品经过了盐析有可能盐浓度较高，可能会影响层析；
2. 一般使用中性pH值，最好选取两个点，比如7.0和8.0进行测试，这样可以根据测试的电泳结果来判断目的蛋白结合的趋势；
3. 一般而言，可以先试阴离子交换，最好阴、阳离子能同时测试。

后续的实验设计需要在前期的测试基础进行。
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小兵一个
2楼2012-10-20 09:10:16
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
scelab: 金币+5, MicEPI+1, good 2012-10-20 17:17:01
引用回帖:
3楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-10-20 15:42:34
先做粗酶液pH稳定性的实验，确定了稳定范围之后再选择层析柱。
Effect of pH and temperature on glucoamylase activity and stability
The effect of pH on glucoamylase activity is measuring glucoamylase ac ...

例如这个酶的pH温度范围很广，4-10都可以使用阴和阳，选择就无限制了。

图片1.jpg
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2012-10-20 15:46:44
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