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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » qPCR时RNA定量过，但内参还是不齐，被老板讲，好悲剧
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dujun2002

金虫 (小有名气)

[求助] qPCR时RNA定量过，但内参还是不齐，被老板讲，好悲剧

用18S做内参做qPCR，CT值居然是16，13，10.相差太大。提RNA时已定量，反转时用2ug RNA。即使是我上样不准，也不应该相差如此大。

苦想原因中。。。高手在不在啊？
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1楼 2012-10-10 01:04:53
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dujun2002: 金币+6, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-10-10 10:26:38
你的内参的确差得太多了，我做的内参的差别都在0.5CT以下。你是用nanodrop定量的RNA吗？你有没有跑一下RNA看看条带。还有就是你有没有做负对照看看RNA样品里是不是有DNA的污染。还多选几个不同的内参看看。此外，根据你的CT值，你的cDNA是不是浓度有点高了。反转录的时候可以少用点RNA。
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dujun2002
3楼2012-10-10 08:21:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by dujun2002 at 2012-10-10 10:04:39
目的基因的CT在25－30。...

目的基因的CT范围还好，内参CT值偏小了。不过，重点是RNA的质量和纯度，这个在做反转录前先确定好。
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8楼2012-10-10 10:13:00
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普通回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dujun2002: 金币+2, ★有帮助, 谢谢 2012-10-10 10:26:11
提RNA后，反转录前，是否有处理DNA啊楼主？
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2楼2012-10-10 08:18:33
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dujun2002

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-10 08:21:25
你的内参的确差得太多了，我做的内参的差别都在0.5CT以下。你是用nanodrop定量的RNA吗？你有没有跑一下RNA看看条带。还有就是你有没有做负对照看看RNA样品里是不是有DNA的污染。还多选几个不同的内参看看。此外，根 ...

的确是nanodrop定量的。
260/280在1.9左右，个人就觉得RNA质量还可以了，恐怕还是要跑电泳看才行。
反转时用2ugRNA，是不是多了些？
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4楼2012-10-10 09:09:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

纯的RNA的260/280应该是2，1.9的话有可能有DNA污染。你跑下电泳看看RNA有没有降解。反转用多少RNA要根据你的目的基因来决定，大家常用的是1ug。单从你的内参看是有点多。不知道你的目的基因的CT大概都是多少呢？
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5楼2012-10-10 09:27:15
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xw19880905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dujun2002: 金币+2, ★有帮助, 谢谢 2012-10-10 10:27:06
这个应该是DNA污染了，你在反转时有没有DNA酶处理
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6楼2012-10-10 09:36:14
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dujun2002

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-10 09:27:15
纯的RNA的260/280应该是2，1.9的话有可能有DNA污染。你跑下电泳看看RNA有没有降解。反转用多少RNA要根据你的目的基因来决定，大家常用的是1ug。单从你的内参看是有点多。不知道你的目的基因的CT大概都是多少呢？

目的基因的CT在25－30。
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7楼2012-10-10 10:04:39
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心存理工
9楼2012-10-10 10:36:47
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1223163317

新虫 (初入文坛)
你好，你的内参不齐的问题最后怎么解决的，求助啊？
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10楼2015-07-09 14:24:26
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