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dujun2002

金虫 (小有名气)

[求助] qPCR时RNA定量过,但内参还是不齐,被老板讲,好悲剧

用18S做内参做qPCR,CT值居然是16,13,10.相差太大。提RNA时已定量,反转时用2ug RNA。即使是我上样不准,也不应该相差如此大。

苦想原因中。。。高手在不在啊?
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
dujun2002: 金币+6, ★★★很有帮助, 谢谢 2012-10-10 10:26:38
你的内参的确差得太多了,我做的内参的差别都在0.5CT以下。你是用nanodrop定量的RNA吗?你有没有跑一下RNA看看条带。还有就是你有没有做负对照看看RNA样品里是不是有DNA的污染。还多选几个不同的内参看看。此外,根据你的CT值,你的cDNA是不是浓度有点高了。反转录的时候可以少用点RNA。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

3楼2012-10-10 08:21:25
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
dujun2002: 金币+2, 有帮助, 谢谢 2012-10-10 10:26:11
提RNA后,反转录前,是否有处理DNA啊楼主?
2楼2012-10-10 08:18:33
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dujun2002

金虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-10 08:21:25
你的内参的确差得太多了,我做的内参的差别都在0.5CT以下。你是用nanodrop定量的RNA吗?你有没有跑一下RNA看看条带。还有就是你有没有做负对照看看RNA样品里是不是有DNA的污染。还多选几个不同的内参看看。此外,根 ...

的确是nanodrop定量的。
260/280在1.9左右,个人就觉得RNA质量还可以了,恐怕还是要跑电泳看才行。
反转时用2ugRNA,是不是多了些?
4楼2012-10-10 09:09:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

纯的RNA的260/280应该是2,1.9的话有可能有DNA污染。你跑下电泳看看RNA有没有降解。反转用多少RNA要根据你的目的基因来决定,大家常用的是1ug。单从你的内参看是有点多。不知道你的目的基因的CT大概都是多少呢?
5楼2012-10-10 09:27:15
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