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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达载体的构建
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lxh502976898

金虫 (小有名气)

[交流] 原核表达载体的构建 已有17人参与

我第一次接触原核表达载体的构建 就一直连接不成功 回收后的目的片段和表达载体做电泳都有单一条带，二者连接液没有任何条带（我用的是宝生物胶回收试剂盒，DNA的浓度特别低，怀疑是这个原因） 无法判断是否连接成功 。前两次直接做转化也没有任何菌长出来，继续帮助，实验停滞了 谢谢啦。。。。
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1楼 2012-08-23 09:53:28
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

sky_fly

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-08-27 13:46:54
amisking: 回帖置顶 2012-08-28 19:33:48
转化转不出来应该从以下几个方面找原因：
1.感受态细胞是否有效，因此每次转化时都应该做阳性对照
2.酶切是否有效，一般先连T载体，然后酶切连表达载体是最有效的方法，但是成本也是最高的。如果直接酶切PCR产物的话，一定要加保护碱基，不然导致切不动，另外酶切时间不能过长，一般为三个小时，过长的话酶会有星活力的表现
3.连接比例是否合适，载体和基因的浓度太低或者太高都会影响连接效率，一般连接体系可以设置为20ul及以下，载体的量一般为60ng,基因的量控制在60ng-100ng之间
希望对你有帮助
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绝望越大，突破就越大
13楼2012-08-26 11:22:32
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cliakro

木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不懂哇……路过的爬过……
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3楼2012-08-23 10:00:05
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09丁于飞

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
做转化没有任何菌长出来，说明转化有问题，不能确定连接结果如何。另外，DNA回收产物跑胶能看到带，说明DNA浓度足够作连接了。
一般不会用连接液跑胶。
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4楼2012-08-23 13:43:33
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sd3824289

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-08-24 10:53:21
虫有啊  你们在胶回收之前的双酶切 质粒都加多少啊 反应体系是多少  急需 谢谢赐教...

反应体系：
质粒：5μL
E1   ：0.5μL
E2   ：0.5μL
buff ：1μL
dd水：3μL
共10μL
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
11楼2012-08-25 09:06:26
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mgangle

铁杆木虫 (著名写手)

乐乐家族-----乐颠颠
★
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10楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-08-25 08:37:31
你的胶回收之前的双酶切 是怎么做的 酶切体系中质粒加多少啊...

一般就看你的质粒浓度，我喜欢多加质粒，这样浓度大，好连接，连接也就是一种布朗运动，是随机的浓度高碰撞到一起的可能性也高！
质粒53ul 酶1 2ul 酶2 2ul 10*buffer 6ul，这个是可以调节的！
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麦兜麦兜~~~我要一碗鱼丸粗面。。对不起，么有鱼丸粗面。。那，我要鱼丸么有鱼丸那，我要粗面…………么有粗面那，我要鱼丸粗面……………………
12楼2012-08-25 21:23:24
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lecou

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我的酶切体系一般较大，因为怕回收效率等影响会使的最终量很低，我都是50微升，里面DNA大约都十几到二十。连接体系都是比较小25微升，目的片段和质粒的比例都在5：1到10；1，仅供参考，祝你好运
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希望自己能平常心面对实验中的种种
36楼2012-08-31 14:29:29
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普通回帖

cliakro

木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
"继续帮助"……　强！虫子立起！
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2楼2012-08-23 09:59:19
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gelois

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们回收了载体和目的片段之后，就去做共转化了，如果你回收的浓度较低，可以适当的加大体积，不过载体和目的片段的总体积不能超过感受态的1/10.
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5楼2012-08-23 14:21:09
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sd3824289

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
建议你换一下Promege的胶回收盒子，这个回收效果还不错！
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
6楼2012-08-24 10:14:12
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by sd3824289 at 2012-08-24 10:14:12
建议你换一下Promege的胶回收盒子，这个回收效果还不错！

虫有啊  你们在胶回收之前的双酶切 质粒都加多少啊 反应体系是多少  急需 谢谢赐教
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7楼2012-08-24 10:53:21
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jiangyhai

金虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-08-24 10:53:21
虫有啊  你们在胶回收之前的双酶切 质粒都加多少啊 反应体系是多少  急需 谢谢赐教...

目的片段的酶切是PCR产物吗？
如果是的话，很可能是目的片段酶切不彻底。
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静心做事。
8楼2012-08-24 13:31:57
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mgangle

铁杆木虫 (著名写手)

乐乐家族-----乐颠颠
★ ★
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小丹木木: 金币+1, 股交流 2012-08-27 13:47:09
一般载体1ul，目的片段4ul，连接酶及buffer5ul，这个是用Takara的SolutionI连接的体系，还有你要检查一下自己的转化是否有问题，下次转化时，同时做一个载体质粒的转化来检验此次转化的效率。
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麦兜麦兜~~~我要一碗鱼丸粗面。。对不起，么有鱼丸粗面。。那，我要鱼丸么有鱼丸那，我要粗面…………么有粗面那，我要鱼丸粗面……………………
9楼2012-08-24 15:00:12
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by mgangle at 2012-08-24 15:00:12
一般载体1ul，目的片段4ul，连接酶及buffer5ul，这个是用Takara的SolutionI连接的体系，还有你要检查一下自己的转化是否有问题，下次转化时，同时做一个载体质粒的转化来检验此次转化的效率。

你的胶回收之前的双酶切 是怎么做的 酶切体系中质粒加多少啊
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10楼2012-08-25 08:37:31
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