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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 化学分析 » 求助 磁珠接DNA以及其吸附问题！！！！！！！！！
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banlangeny

银虫 (小有名气)

[求助] 求助 磁珠接DNA以及其吸附问题！！！！！！！！！

在修饰了-COOH的磁珠上连接NH3修饰的DNA（29碱基），再将罗丹明修饰的DNA（14个碱基）杂交在上述DNA上。
    具体操作为：取100 ul 磁珠，用200 ul 的咪唑盐酸（ph=6.8）清洗三次，磁分离后，用咪唑盐酸还原为100ul体系，再加入400 ul EDC(0.1M，现配现用）超声1min后活化1h，磁分离后加入200 ul TAE(ph=8.0) buffer。取10 ul 0.00001M 用NH3修饰的DNA加入10 ul 咪唑盐酸（ph=6.8）混合30min后加入到用TAE稀释的磁珠中，在摇床中震荡下，37度，反应12h。磁分离，用200 ul PBS(ph=9.0)的清洗三次，加入200 ul TAE(ph=8.0) buffer，再加入10 ul 0.00001M 罗丹明修饰的DNA，在37度下杂交2 h。磁分离，用200 ul PBS(ph=9.0)的清洗7次，将最后四次清洗液混合在分光光度计上测荧光，磁珠用TAE稀释后去激光共聚焦上拍照。
   结果：1，在激光共聚焦上拍的照片显示，有的时候接的非常均匀，荧光可以在单个磁珠上显示，但多数的实验荧光是在磁珠聚集团的上面显示，单个磁珠不能显示荧光
           2，最后四次的混合液测荧光发现还是有信号，说明前三次清洗不干净
  问题：1，如何清洗磁珠，使磁珠对DNA的吸附降到最低。
           2，磁珠接DNA,如何使DNA能够尽量多的并且均匀的连接在磁珠上。
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1楼 2012-08-20 15:10:29
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罗淑芬

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

用含0.05%的Tween-20的PBS缓冲溶液冲洗效果会比较好。。。
  至于连接的更均匀，连接期间好不好晃动，每一个小时晃动一下效果比较好，我用的就是磁珠。。。
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8楼2012-09-12 08:48:52
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luzhuoxuan

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
banlangeny: 金币+1 2012-08-21 08:57:36
1 要均匀的话，在摇床中震动是否合适，一般选择恒温振荡器，即便如此大概每半个小时，要到涡旋仪上强涡旋1分钟。再试试看时间，觉得正常情况下无需12个小时那么长，可以参考下英骏它们试剂盒的一些操作方式。
2 降低背景，可以用杂交温度稍微提高一点，或者杂交时间减少一些，也可以更换一下洗涤液的配方。
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3楼2012-08-20 21:15:43
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banlangeny

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by caizeyuan922 at 2012-08-20 21:46:02
5楼2012-08-21 08:58:17
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stavexiao

银虫 (小有名气)
请问你的磁珠是自己做的 还是买的？如果是买的请问从哪个公司买的？
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6楼2012-08-21 10:15:09
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