| 查看: 2362 | 回复: 14 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
sxxuan金虫 (著名写手)
|
[求助]
最近做T克隆都是阴性，怎么回事？
|
|
|
一直做T克隆都觉得效率不高，但每次都能拿到阳性的重组菌就没有多想怎么去改善，但是最近出了很大的问题，都是阴性，或者鉴定时候有很多非特异性条带，送测序之后测序公司告知两次摇菌都不成功，测序失败。 1.PCR产物不是我做的，但是每次克隆前都会先跑胶确认条带。 2.纯化都选用生工的试剂盒 3.载体都是pMD18-T，有时候用附带的solutionI,有时候用NEB的T4连接酶 4.最普通的转化方法，冰浴30min，42℃90s，冰上3min，加入LB后培养1h后6000rpm离心3min，取出多余的LB，一般剩100ml，重悬后涂板。 5.感受态都是用0.1M CaCl2制备的，JM109，OD600=0.4~0.45，100ml菌液最后用5mlCaCl2重悬，加入1ml甘油混匀，100ul分装。-80保存 大概的步骤就是这样，但转化长出来的菌落都不多，30来个是正常，好一点就五六十个，请问是感受态效率不高，还是连接效率不高？还是都 不高？可以怎么改善呢？请大家提出宝贵的意见或说说自己是怎么做的也好，谢谢！ |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有149人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
13楼2013-05-20 08:54:21
2楼2012-07-27 21:01:53
scutphoenix
木虫 (正式写手)
- 应助: 8 (幼儿园)
- 金币: 2294.6
- 散金: 150
- 红花: 1
- 帖子: 520
- 在线: 53.8小时
- 虫号: 348663
- 注册: 2007-04-18
- 专业: 病毒学
3楼2012-07-28 00:31:14
4楼2012-07-28 01:39:45