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sxxuan金虫 (著名写手)
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[求助]
最近做T克隆都是阴性，怎么回事？
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一直做T克隆都觉得效率不高，但每次都能拿到阳性的重组菌就没有多想怎么去改善，但是最近出了很大的问题，都是阴性，或者鉴定时候有很多非特异性条带，送测序之后测序公司告知两次摇菌都不成功，测序失败。 1.PCR产物不是我做的，但是每次克隆前都会先跑胶确认条带。 2.纯化都选用生工的试剂盒 3.载体都是pMD18-T，有时候用附带的solutionI,有时候用NEB的T4连接酶 4.最普通的转化方法，冰浴30min，42℃90s，冰上3min，加入LB后培养1h后6000rpm离心3min，取出多余的LB，一般剩100ml，重悬后涂板。 5.感受态都是用0.1M CaCl2制备的，JM109，OD600=0.4~0.45，100ml菌液最后用5mlCaCl2重悬，加入1ml甘油混匀，100ul分装。-80保存 大概的步骤就是这样，但转化长出来的菌落都不多，30来个是正常，好一点就五六十个，请问是感受态效率不高，还是连接效率不高？还是都 不高？可以怎么改善呢？请大家提出宝贵的意见或说说自己是怎么做的也好，谢谢！ |
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