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Western Blot的问题（关于重复性和显色）
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WB新手，最近遇到很多WB问题，下面一一列举，请各问高手指教啊！ 1，前段时间做内参基因GAPDH，一直都挺好，最近两次用的是相同的条件（一抗、二抗、显色液用的是一样的），可能稍微不同的就是上样量从20ug变成10ug，封闭时间每次比较随意，半小时到一小时不等，一抗有时在4度过夜，有时室温两小时到三小时，TBST洗的次数有时候7、8次，有时3、4次，二抗室温70min，这些不同在我的理解对结果没有致命影响，不知道对不对啊？ 2，都说ECL显色液加到膜上后，需要孵育1~2min，可是我的是加上后就有很强的荧光，而且荧光持续的时间大概就5~6min就猝灭了，这是什么原因呢？有人说是二抗浓度过高，导致底物很快消耗，但是我降低二抗的浓度同时也降低上样量了（20ug，不算大吧？），还是一样很快猝灭。用的是天根ECL，怎么办呢？会不会是每次去暗室都把显色液在常温放一段时间，然后不好了？ 再次感谢！ |
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