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chjinzhi银虫 (正式写手)
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[求助]
关于利用融合PCR技术进行点突变的问题 已有3人参与
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各位大侠，我现在在做融合PCR以实现酶切位点的点突变，但我做了将近半年仍做不出结果，急需要大家的帮助！ 我的扩增片段总共1400bp左右，扩增片段一个390bp左右，一个1100bp左右，两片段有23bp的重叠。重叠时总是扩增出小片段，不能得到目的片段！重叠时的温度我从62度到35度都做了一遍。但都没有目的片段。 |
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biology-girl
新虫 (正式写手)
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2楼2014-07-23 11:49:07
【答案】应助回帖
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有可能出问题的地方很多，信息不太全只能稍微猜测一下： 1. 酶。基因片段超过1kbp的话最好用好一些的酶，普通的taq酶估计很难做出来 2. 模板纯度。你的两个片段重叠时需要保证片段的纯度都比较高，而且片段浓度要一致，不能相差太多。 3. 延伸时间，可以试着延长延伸时间，重叠pcr的阅读速度比一般pcr要慢些 暂时想到这么多。 不过如果你是做点突变的话，应该就是要把一个基因片段中的一个酶切位点突变吧？如果只是一个基因片段完全没必要做融合pcr，可以直接用普通pcr做点突变. -将你的目的基因连在小体积载体上 -设计一对完全互补的引物覆盖你要突变，扩增整个载体，当然这里需要特殊的聚合酶，可以扩增几kbp的大片段 -酶处理降解模板载体，只留下扩增产物，即已点突变的载体 -转染感受态，涂板，挑菌落，提质粒，测序 实验方案不超过两天，加上测序最多也就一周。而且不少试剂盒可以做点突变。 |
3楼2014-07-24 03:58:54
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4楼2014-07-24 04:31:14