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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 镍柱蛋白纯化，求好心人讲解。
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小叶子猫

银虫 (小有名气)

[求助] 镍柱蛋白纯化，求好心人讲解。

最近要做蛋白纯化，用pet30a做载体表达目的基因，pet30a已经有his-tag了，请问自己设计引物的时候是不是就不需要再添加his-tag了？pet30a上的肠激酶和凝血酶是干什么用的？是需要将蛋白进行切割吗？另外，诱导表达的菌液该如何进行前处理？大恩不言谢啊，thank you !
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1楼 2012-07-19 16:52:33
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impasse

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

选择高比活的凝血酶，好的可以达到2000u/mg以上,这样的凝血酶纯度很高，基本单一组分，没有杂蛋白酶活性，切割为点单一，也不会引入新的组分，去除的时候挂一下肝素凝胶柱就可以了，现在国产的凝血酶就可以达到这个纯度，也比进口的便宜很多。http://baiyingswkj.cn.alibaba.com/
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5楼2012-10-09 23:37:23
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xhjggl

木虫 (正式写手)
可以找上海生工帮做
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2楼2012-07-19 18:06:05
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助，很热心哦 2012-07-20 13:44:47
小叶子猫: 回帖置顶 2012-10-10 09:54:50
载体上已经有His Tag的话，设计引物的时候就不必再添加了。那两种酶切位点是之后蛋白纯化的时候如果需要可以进行酶切，达到进一步纯化，如果你不用酶切的话可以不用管它。
诱导表达的话，你先做小剂量看是否有表达，如果有表达就可以扩大培养了。扩大培养的时候，一般是先在37度摇床生长3-4个小时，然后取样测OD，不清楚你的蛋白的性质，一般的蛋白都是等OD值长到0.6的时候，取诱前，然后开始降温（18度一小时），一小时之后就可以加IPTG诱导了，然后18度过夜培养，第二天过来测OD，取诱后，收菌。
当然，如果你的蛋白是要做包涵体的话，就不用降温了，可是直接37度诱导4个小时之后就收菌。
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3楼2012-07-20 08:58:20
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果用Nco I 酶切位点的话，注意后面紧跟的CT，不要移码突变了。
记得加终止密码子。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
4楼2012-07-20 09:39:31
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