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cuiwen_tao

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求问一个问题，dNTP浓度过低是否在PCR反应中就会形成引物二聚体 谢谢

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1楼 2012-07-18 11:18:05
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 真是热心的虫虫啊 2012-07-18 13:55:35
cuiwen_tao: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-07-18 15:28:02
怎样减少减少引物二聚体？
参考见解：
1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；
2. 可能模板有问题；
3. 模板浓度过小，适当加大模板量；
4. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；
6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；
7. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
8. 增加循环数；
9. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；
10. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。
11. 以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍。
影响平台效应的因素有哪些？
参考见解：
1、 反应试剂（dNTP或酶）稳定性的改变；
2、 终产物（如焦磷酸）的抑制效应；
3、 产物浓度超过10-5时可产生重复退火，于是会降低引物延伸速率或DNA聚合酶的活性。
4、 高浓度产物DNA双链的解链不宝剑。平台效应时的一种重要后果是由于错误引导，在开始时浓度不高的非特异产物会继续扩增，使结果的分析复杂化。
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coasttocoast。
3楼2012-07-18 12:02:11
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普通回帖

cuiwen_tao

铜虫 (初入文坛)
主要是一直引物二聚体很明亮，条带没有，但是有一次我误加多了dNTP缺出现了目的条带。
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2楼2012-07-18 11:21:25
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jl860822

金虫 (正式写手)
每50μl体系加4-5μl的dNTP，这个量足够做40次以上的扩增，所以我感觉应该不是dNTP的问题，你考虑一下其他的因素吧
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4楼2012-07-18 16:00:55
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
3楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-18 12:02:11
怎样减少减少引物二聚体？
参考见解：
1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；
2. 可能模板有问题；
3. 模板浓度过小，适当加大模板量；
4. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低 ...

用产物作为模版再p一次，25微升体系加多少产物呢？
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5楼2012-11-28 19:43:38
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cxb-abc

银虫 (小有名气)
内容已删除
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6楼2014-10-28 09:40:15
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