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593318518

新虫 (小有名气)

[求助] 使用E.coli复制质粒,提取质粒产量很低

问题如题,使用invitrogen的TOP 10 Chemically Competent cell作为宿主菌复制PCR2.1 载体携带基因的质粒。culture体积是10ml, 挑单菌落接种,抗性是Gentamicin,我是在菌液OD达到1.5之后才提取质粒的。质粒提取用的是qiagen的试剂盒,最后使用50ulEB洗脱,但是质粒浓度很低。这是为什么了?
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593318518

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 陈年芬芳 at 2012-07-10 16:33:49
你培养体积很大了,但OD不高,培养的时候盖子不要扭太紧,以免影响溶氧。另外提质粒时,一般4mL菌液(过夜培养)足够。buffer 2孵育一定要2min左右,不要超过4min。洗脱时,将Elution buffer加入后,60度温箱2min, ...

不同机器OD不同,看来我不该说OD指标。总之我摇菌将近24小时,很浓了。是culture tube溶氧应该没问题。就是因为5ml或者几毫升提的质粒量少才换成10ml的。而且buffer1-3都是double了体积。终浓度只有50上下。关键是其他基因我提的都很高,唯独就是这个基因
10楼2012-07-10 23:29:43
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
首先你的OD略低,而且不知道你提质粒用了多少的菌液?一般是3-5ml,还是在菌液浓度很好的情况下。
2楼2012-07-09 09:00:52
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以减少洗脱体积,我一般3ml菌液最后用35ul的洗脱体积
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
3楼2012-07-09 09:46:40
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-09 09:00:52
首先你的OD略低,而且不知道你提质粒用了多少的菌液?一般是3-5ml,还是在菌液浓度很好的情况下。

是 有点低了,一般提取质粒,是将菌液过夜培养后再提取,OD应该在10以上了吧?
过夜菌液4ml,肯定没问题。
VX:19192310212;公众号:生物技术与IVD
4楼2012-07-09 10:10:17
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