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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

[求助] 请大家帮忙分析一张酶切图，双酶切片段有点诡异

所切质粒为pMD19-T（2692bp）连接有目的片段（1926bp），连接成功后总质粒大小为4618bp，酶切位点为：Not I与BamH I
如图所示：
单酶切验证质粒应该是连上了目的片段，但是Not I酶切效率极其低下，双酶切因此也好不到哪去，我用的Not I单酶切体系来自于说明书如下：
质粒：2ul
Not I：1ul
10*H buffer：2ul
0.1%BSA：2ul
0.1%Tritonx-100：2ul
水：11ul
总计：20ul体系，过夜酶切，37℃
从图中看出双酶切片段很多很杂，尤其是1000bp及以下的两条片段无法判断是什么，我目的片段中并不包含BamH I和Not I这两个酶切位点，难道我P出来的不是目的片段，而是非特异性条带
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1楼 2012-07-04 10:37:03
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tianyinghu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-04 13:53:21
不明白一点：1-3质粒对照，你的质粒理论大小为4618bp虽然存在2级结构，但这也相差太大了吧，4-6为BamHI单酶切理论应该有4618bp了吧，可是连3KB都没到，但NotI缺切出4kb的条带，从7-9可以推出构建好的质粒里面有2个NotI的酶切位点，如果是2个酶切位点的话那么10-12也就好解释了。
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2楼2012-07-04 12:13:54
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
引用回帖:
2楼: Originally posted by tianyinghu at 2012-07-04 12:13:54
不明白一点：1-3质粒对照，你的质粒理论大小为4618bp虽然存在2级结构，但这也相差太大了吧，4-6为BamHI单酶切理论应该有4618bp了吧，可是连3KB都没到，但NotI缺切出4kb的条带，从7-9可以推出构建好的质粒里面有2个N ...

4-6有3000吧，仔细看一点，明显在3000的mark上面，但是按道理，4-6单酶切跟7-9单酶切出来的片段是一样的，质粒里面只有一个Not I酶切位点，目的片段里面也排除了Not I位点，除非我扩增片段的时候出现突变或者我扩增出的根本就不是目的片段.
另外，1-3质粒对照的条带大小问题，我拿了一个4900的质粒作对照跑过，1-3在这个4900质粒稍微下面一点点，所以对照质粒的大小应该没有问题.
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3楼2012-07-04 12:29:21
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