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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 定量PCR的熔解曲线分析和PCRmix的选择
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xiao7270

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 定量PCR的熔解曲线分析和PCRmix的选择

各位定量PCR的虫侠们：
小虫第一次做定量PCR，关于熔解曲线的分析程序问题很大！我用的是ABI 7900HT仪器，做相对定量的时候，熔解曲线分析程序不能直接加在反应程序后面。程序跑完后，手动开始熔解曲线的分析，用的是仪器自带的默认程序，95度15s，60度15s，95度15s，40个循环。然而此时，问题出现了，仪器自动分析该程序跑完需要7.5小时，我等了3个循环，约用了50分钟。
请做过定量PCR 的虫侠们帮我分析一下，问题到底出在哪里？
--------------------------------我是第一和第二问题的分割线-----------------------------------
另外一个问题，有不带UDG酶的Fast Sybr Green Master Mix的产品么（无论哪家公司）？或者使用带有UDG酶的qPCRmix，而在反应开始之前不设置50度的UDG酶反应，应该不会对反应有太大影响吧？

[ Last edited by xiao7270 on 2012-7-4 at 13:30 ]
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1楼 2012-07-04 08:42:08
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xiao7270

至尊木虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by chlorella409 at 2012-07-05 11:22:44
祝实验成功

收到祝福很开心，
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7楼2012-07-05 14:59:48
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chlorella409

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xiao7270: 金币+2, 谢谢！不好意思写错了，是50度2min 2012-07-04 13:31:05
我们使用没有UDG的Mix,区别应该不会很大，但是我觉得你的UDG反应时间是不是设置错了，不可能要50分钟吧
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2楼2012-07-04 11:19:26
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chlorella409

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xiao7270: 金币+2, 谢谢提供详细信息！看样子论坛里用7900的虫很少啊，呵呵 2012-07-05 11:02:29
Q1,使用含UDG的mix，2分钟UDG反应时间，加上40个循环30min,总的时间应该在一小时以内，我们使用7500 FAST大概在一小时二十分钟左右，因为7500自带溶解曲线设定，扩增完成后自动做溶解曲线，整个实验在两小时左右，所以我觉得你的7.5个小时是不是程序设置上有问题。Q2，UDG酶是用于PCR过程中扩增产物防污染的，根据个人需要随便选择而已
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3楼2012-07-04 13:47:32
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xiao7270

至尊木虫 (著名写手)
lz弄清楚了，关于7900不能直接设置熔解曲线的事，问了ABI公司的技术支持，说，设置好程序后，保存，关闭该程序，再重新打开该程序，就可以添加熔解曲线分析了。另外，该分析是一个循环，即95度15s，60度15s，95度15s，升温过程缓慢，约20～30分钟。
第二个问题，有UDG酶和无UDG酶对反应本身影响不大，主要是看使用者是不是怕污染，怕的话就用50度2min保温一下，不用该过程也行。
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5楼2012-07-05 11:07:51
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