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xiao7270

至尊木虫 (著名写手)


[交流] 定量PCR的熔解曲线分析和PCRmix的选择

各位定量PCR的虫侠们:
小虫第一次做定量PCR,关于熔解曲线的分析程序问题很大!我用的是ABI 7900HT仪器,做相对定量的时候,熔解曲线分析程序不能直接加在反应程序后面。程序跑完后,手动开始熔解曲线的分析,用的是仪器自带的默认程序,95度15s,60度15s,95度15s,40个循环。然而此时,问题出现了,仪器自动分析该程序跑完需要7.5小时,我等了3个循环,约用了50分钟。
请做过定量PCR 的虫侠们帮我分析一下,问题到底出在哪里?
--------------------------------我是第一和第二问题的分割线-----------------------------------
另外一个问题,有不带UDG酶的Fast Sybr Green Master Mix的产品么(无论哪家公司)?或者使用带有UDG酶的qPCRmix,而在反应开始之前不设置50度的UDG酶反应,应该不会对反应有太大影响吧?

[ Last edited by xiao7270 on 2012-7-4 at 13:30 ]
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chlorella409

木虫 (正式写手)


祝实验成功

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6楼2012-07-05 11:22:44
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chlorella409

木虫 (正式写手)


★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
xiao7270: 金币+2, 谢谢!不好意思写错了,是50度2min 2012-07-04 13:31:05
我们使用没有UDG的Mix,区别应该不会很大,但是我觉得你的UDG反应时间是不是设置错了,不可能要50分钟吧
2楼2012-07-04 11:19:26
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chlorella409

木虫 (正式写手)


★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
xiao7270: 金币+2, 谢谢提供详细信息!看样子论坛里用7900的虫很少啊,呵呵 2012-07-05 11:02:29
Q1,使用含UDG的mix,2分钟UDG反应时间,加上40个循环30min,总的时间应该在一小时以内,我们使用7500 FAST大概在一小时二十分钟左右,因为7500自带溶解曲线设定,扩增完成后自动做溶解曲线,整个实验在两小时左右,所以我觉得你的7.5个小时是不是程序设置上有问题。Q2,UDG酶是用于PCR过程中扩增产物防污染的,根据个人需要随便选择而已
3楼2012-07-04 13:47:32
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xiao7270

至尊木虫 (著名写手)


lz弄清楚了,关于7900不能直接设置熔解曲线的事,问了ABI公司的技术支持,说,设置好程序后,保存,关闭该程序,再重新打开该程序,就可以添加熔解曲线分析了。另外,该分析是一个循环,即95度15s,60度15s,95度15s,升温过程缓慢,约20~30分钟。
第二个问题,有UDG酶和无UDG酶对反应本身影响不大,主要是看使用者是不是怕污染,怕的话就用50度2min保温一下,不用该过程也行。
5楼2012-07-05 11:07:51
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