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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[求助] 求助：亚克隆做不出来

TA克隆做完了，然后做亚克隆，是用Nhe I和Hind III分别双酶切表达载体和TA克隆产物，但是现在做亚克隆时转化后总是没有阳性克隆，是什么原因呢？！
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1楼 2012-06-13 10:31:34
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bst5

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 热心的虫虫 2012-06-13 13:50:53
要分析原因就太多了
第一，之前TA克隆是否正确
第二，酶切是否切开
第三，培养基抗生素时候加错
第四，连接是否连上
。。。
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2楼2012-06-13 10:41:06
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bst5 at 2012-06-13 10:41:06
要分析原因就太多了
第一，之前TA克隆是否正确
第二，酶切是否切开
第三，培养基抗生素时候加错
第四，连接是否连上
。。。

TA克隆的测序结果是正确的，只是甘油管保存一个月的话应该不会发生突变吧！
酶切后跑电泳了，条带是在我要的目的片段的大小！
培养基的抗生素应该不会有问题，我是用同一批的板从甘油管中接菌然后转接第二代菌的。
现在最担心的是连接的问题了，但是用的体系是跟以前一样的，之前做的亚克隆的转化有阳性克隆的。
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3楼2012-06-13 10:52:22
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bst5

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

最好做一个连接的阳性对照，比如同时连一个T载体，看有无阳性克隆，要是有就不是连接的问题啊
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4楼2012-06-14 09:21:48
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bst5 at 2012-06-14 09:21:48
最好做一个连接的阳性对照，比如同时连一个T载体，看有无阳性克隆，要是有就不是连接的问题啊

嗯，好的，谢谢
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5楼2012-06-14 14:16:43
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bst5 at 2012-06-14 09:21:48
最好做一个连接的阳性对照，比如同时连一个T载体，看有无阳性克隆，要是有就不是连接的问题啊

连接的阳性对照应该怎么做呢？怎么样连T载体呢？！T载体能自连吗？
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6楼2012-07-29 09:42:32
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