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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 蛋白表达量的提高
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675250244

银虫 (小有名气)

[交流] 蛋白表达量的提高

最近用pET32a为载体表达一蛋白（30多KD），发现产量太低了，想通过优化培养基配方（如添加甘油等）提高其表达量，但一直不见效果，求解答。
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1楼 2012-06-05 08:44:56
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yuzhiming

捐助贵宾 (知名作家)
★
675250244(金币+1): 谢谢参与
增加IPTG浓度
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3楼2012-06-05 08:56:20
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
675250244(金币+1): 谢谢参与
scelab: 金币+2, 谢谢回复哦~ 2012-06-06 23:01:28
优化温度；IPTG浓度；实在不行只能进行密码子优化.
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8楼2012-06-05 13:05:41
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caoluoyuan

金虫 (正式写手)
★
675250244(金币+1): 谢谢参与
诱导型表达载体，增加诱导剂的量是促进表达的方法，试试看
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9楼2012-06-05 14:47:20
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yfzhang2008

木虫 (小有名气)
★
675250244(金币+1): 谢谢参与
从头找原因
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10楼2012-06-06 08:23:39
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flownaway

铁杆木虫 (正式写手)
★
675250244(金币+1): 谢谢参与
加入IPTG，优化一下诱导的浓度、时间和温度，再试试从对数期开始诱导
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12楼2012-06-06 11:35:33
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chz16160520

银虫 (小有名气)
★
675250244(金币+1): 谢谢参与
无论你怎么折腾有些蛋白的表达量就是那么低，我现在就是！你可以尝试换一下菌种，或者用酵母来表达（如果基因来源于真核生物）
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14楼2012-06-06 22:34:37
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675250244

银虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by chz16160520 at 2012-06-06 22:34:37
无论你怎么折腾有些蛋白的表达量就是那么低，我现在就是！你可以尝试换一下菌种，或者用酵母来表达（如果基因来源于真核生物）

我的是一个原核生物的抗原，连上了CTB佐剂，用的载体是pET32a，菌株是BL21（DE3），现在表达的量总共有50mg/L,其中以包涵体形式表达占了一半，我想提高表达量同时增加以可溶性形式表达
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15楼2012-06-07 08:24:19
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lily_han

金虫 (正式写手)
★
675250244(金币+1): 谢谢参与
难啊，我一个蛋白折腾半年了，可溶的表达量就那么点，纯化也困难
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16楼2012-06-07 10:00:15
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ximuzi2002

铜虫 (小有名气)
★
675250244(金币+1): 谢谢参与
可以分析一下密码子，尤其是前20个氨基酸的密码子，优化一下。
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17楼2012-06-15 15:16:42
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lihao1988903

金虫 (正式写手)
★
675250244(金币+1): 谢谢参与
各种条件优化啊，筛选高表达菌株啊。
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18楼2012-06-15 16:22:44
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limin2012

铜虫 (正式写手)
★
675250244(金币+1): 谢谢参与
优化培养基效果不大。应改变温度，IPTG浓度和通气等条件。
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19楼2012-06-15 17:16:31
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limin2012

铜虫 (正式写手)
换掉稀有密码子，使用大肠杆菌喜好密码。
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20楼2012-06-15 17:21:51
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zfhist

木虫 (正式写手)
★
675250244(金币+1): 谢谢参与
爱莫能助。
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21楼2012-06-15 19:43:24
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zfhist

木虫 (正式写手)
实在抱歉。
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22楼2012-06-15 19:43:42
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416114799

至尊木虫 (知名作家)
★
675250244(金币+1): 谢谢参与
表达量低主要问题还是诱导的问题，而你却去做了优化，优化了培养基只能让菌体长得更好，菌体量多了，可能表达量也对应增加；但是如果诱导的问题没有解决，菌体量再多也无济于事。所以建议从这个入手。如果你的启动子之类的没有问题，如楼上说的加IPTG是一种措施，但是不能够解决所有问题。表达量低原因有很多，最直接的就是IPTG诱导的问题；还有溶氧的问题；还有诱导时温度的问题，pH的问题。你必须结合你的菌，来做调整。一般诱导时温度要比未诱导前低，比如大肠杆菌的发酵最好是37°，但是诱导后就要调到30°。
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23楼2012-06-15 20:25:46
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675250244

银虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by 416114799 at 2012-06-15 20:25:46
表达量低主要问题还是诱导的问题，而你却去做了优化，优化了培养基只能让菌体长得更好，菌体量多了，可能表达量也对应增加；但是如果诱导的问题没有解决，菌体量再多也无济于事。所以建议从这个入手。如果你的启动子 ...

这诱导方面我也进行了优化，但是蛋白的量还是没有很明显的提高，关于溶氧的问题，不知道怎么测定溶氧量？
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24楼2012-06-16 10:09:14
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416114799

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 675250244 at 2012-06-16 10:09:14
这诱导方面我也进行了优化，但是蛋白的量还是没有很明显的提高，关于溶氧的问题，不知道怎么测定溶氧量？...

不会是你发酵没有测定溶氧吧？溶氧是非常关键的，在表达与生长过程中。我们都是用自动溶氧电极。难不成你的发酵罐没有这个玩意儿？
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25楼2012-06-16 11:51:37
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goingabroad2楼
2012-06-05 08:51   回复  
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2009126224楼
2012-06-05 08:59   回复  
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祝福
依窗赏月5楼
2012-06-05 09:08   回复  
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neu2346楼
2012-06-05 09:10   回复  
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幸福的从容7楼
2012-06-05 09:16   回复  
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小花82111楼
2012-06-06 08:55   回复  
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yingying158813楼
2012-06-06 21:03   回复  
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