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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何提高连接效率呢？
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)

[求助] 如何提高连接效率呢？

各位科研上的战友，大家帮我看看分析一下实验失败的原因。
我是从T载体上双酶切（酶为EcoR I和Sal I）下了我的目的片段，然后载体也已经用相同的酶的线性化，做到连接转化这一步老是不成功，很困惑。
连接体系是：
片段        6ul
线性化载体  2ul
T4ligase         1ul
buffer            1ul
total            10ul

16℃反应4h，4℃过夜，之后加100ul感受态。转化

在转化和感受态都是没问题的，因为做了对照试验。
我的浓度比基本都是看条带marker亮度估算的，没用相关仪器来检测准确浓度。
很多战友都说要不断摸索片段和载体的浓度比【这步是否需要呢？】。那这样是否需要很多次的连接转化呢？
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1楼 2012-05-28 16:16:22
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冰风颤木

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by countingcrow at 2012-05-29 06:33:32
有几个问题：
1.  载体上ECOR I 和 Sal I 位点距离会不会太近？一般来说两个克隆位点如果相距太近，会影响酶切效率，导致只有一个位点切开。
2. 载体酶切时条件掌握得好不好，酶切时间会不会太短？如果酶切条件不 ...

你说的 我也有同感  ECOR I 和 Sal I 位点很近 比如pET32a（+）吧 导致二者切不开 电泳一片模糊
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船到桥头自然直
26楼2013-06-29 11:09:07
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查看全部 27 个回答

yunocn

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
比例很重要，一次连接可尝试3种比例
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2楼2012-05-28 17:17:27
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caohaojie316

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以一次尝试很多比例
赞一下 回复此楼
岂能皆尽人意，但求无愧我心！
3楼2012-05-28 21:47:49
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countingcrow

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流，这的确是需要注意的哦 2012-05-29 13:48:11
有几个问题：
1.  载体上ECOR I 和 Sal I 位点距离会不会太近？一般来说两个克隆位点如果相距太近，会影响酶切效率，导致只有一个位点切开。
2. 载体酶切时条件掌握得好不好，酶切时间会不会太短？如果酶切条件不好，会使载体酶切不完全。
3. 感受态细胞的体积是不是考虑搞多一些，否则酶切体系里的甘油会影响转化效率。
4. 载体的抗性基因是不是搞错了，是卡那抗性还是氨苄抗性。
赞一下 回复此楼
4楼2012-05-29 06:33:32
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查看全部 27 个回答
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