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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蓝白斑筛选只长白斑
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早冰124

新虫 (初入文坛)

[求助] 蓝白斑筛选只长白斑

蓝白斑筛选，pUC19检测感受态细胞是转化效率很高，蓝白斑筛选后均为蓝斑，但为何连接产物转化后全是白斑，一个蓝斑都没有，并且菌落PCR检测所有的白色菌落均批不出目的条带，这是什么原因，更奇怪的是BL21做感受态细胞时只出现蓝斑，TOP10做感受态细胞时全是白斑，求解，非常感谢啊！
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1楼 2012-05-19 21:40:37
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zqx128

金虫 (正式写手)
蓝白筛选没有蓝斑也是正常情况，比如你连接的时候载体较少，全部都插入目的片段了。菌落PCR没有批出目的带也不能说明就没有连接转化成功，或许只是PCR条件不合适没有检测出来吧，比如菌落PCR的预变性时间要适当延长。你的目的片段3kb是比较大了，建议菌落PCR检测的时候另外用一对引物，在你目的片段中能扩出500-600bp或者1000bp左右就够了。
另外，你提质粒看大小也是不准确的，因为质粒跑的快慢除了跟大小有关还跟它的状态有关，比如超螺旋型的比线性的跑的快。
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11楼2012-07-18 11:53:52
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damaomao

禁虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
2楼2012-05-20 10:37:49
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xmuring

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-20 18:41:45
早冰124: 金币+1, ★有帮助 2012-05-21 14:51:18
BL21的lacZ基因在基因组上，在IPTG/Xgal平板上本身就是形成蓝色菌落，而TOP10则是通过质粒和基因组的lac基因片段之间α互补才会产生蓝斑。会不会是克隆没做好，连接失败了？lz是否重复过克隆过程？还有就是抗生素会不会有问题。。。另外，菌落PCR用的引物是M13通用引物还是自己设计的？建议lz说的详细点~~~~一不小心就写了这么多，lz多包涵下
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3楼2012-05-20 17:01:20
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早冰124

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by damaomao at 2012-05-20 10:37:49:
我建议重新要宿主菌  有可能宿主菌出问题了

BL21和Top10都是新买来的，经pUC19转化检测发现转化效率很好，怒视菌的问题
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4楼2012-05-21 14:35:49
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