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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于RT-PCR的众多细节
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狼在身边

木虫 (小有名气)

[求助] 关于RT-PCR的众多细节

我提取的是细菌的RNA，浓度在500ng/ul左右，但纯度很低，260/280只在1.6-1.7之间，请问这样的RNA能用吗，感觉细菌的RNA的260/280好像都很低，没有组织和植物的RNA那么好。用这样的RNA反转录之后的荧光PCR效果也不错，现在就很纠结，这种RNA纯度能用吗，请问大家提取的细菌RNA纯度都咋样，我提取RNA的试剂是TAKARA的。
   再有一个现象，提取RNA过程中添加异丙醇离心后没有RNA沉淀，后续乙醇洗脱时心里很虚。请问大家遇到过这样的问题吗？
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1楼 2012-03-28 12:12:32
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小小_木虫

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我是提阳性细菌RNA，不知道你的是什么细菌？之前用的TakaRa的 RNAiso Plus，由于技术不过关，总是降解的厉害，后来就换的天根的试剂盒，跑胶检测还可以，两条带很清晰，我觉得你可以试试。对于最后壁上没有沉淀，我觉得是不是破壁那步骤没有做好，导致根本就没有提出来，我第一次提的时候没有进行破壁就没沉淀。新手交流～～～
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19楼2013-02-26 16:58:02
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wtyyyyy1988

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-03-28 15:07:43
紫外分光测的都不是很准的，关键看你跑的RNA电泳怎么样，电泳上跑的好的话就没什么大问题，不要去在意紫外测的，如果有DNA污染就用Dnase 1c处理下。
没有沉淀是正常的，不要发虚，吸取的时候小心点就OK啦，但是最后你一定要跑个电泳看看啊，千万不要只测紫外而不跑电泳，两者结合最好！
GOOD luck!
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我就是我
2楼2012-03-28 12:58:06
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
RNA微量，所以即使看不到沉淀，但是在乙醇洗涤的时候会看见的。我也有心虚的时候，但是在洗涤的时候总是能看见RNA所以现在也就不心虚了
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3楼2012-03-28 14:45:29
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huang200669

新虫 (初入文坛)
我以前试过，用260/280是2.0、1.8、1.7的RNA分别反转录做荧光，内参的CT值不一样，2.0的CT值是20，1.7的是28，我的是植物RNA。
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4楼2012-03-28 16:15:12
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