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若然飞翔

新虫 (初入文坛)

[求助] 利用CHO进行分泌表达

Sample Text    我想利用CHO细胞分泌表达一个膜蛋白,从上游构建开始,我该如何选择可以在CHO中进行高效表达的载体?如果使用pCDNA3.1,启动子,增强子我该如何处理?如何选择信号肽啊?刚开始接触,有太多不明白的地方了,请大家帮帮忙
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十口心思

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
若然飞翔: 金币+2, 有帮助 2012-03-24 14:25:50
西瓜: 金币+3, Good! 2012-03-25 14:15:27
不必纠结于信号肽,用常用穿膜的,文献里常用的就行。 这不是决定表达量的关键因素,是优化因素。要制备抗体,估计你老板是要做全人抗体。要是做小鼠的,做肽段就行,更不用纯化了。但现在也有不用纯化就可以制备抗体的办法。R&D的蛋白挺全的,你直接买吧。
12楼2012-03-23 22:56:19
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
若然飞翔: 金币+2, 有帮助 2012-03-20 08:36:50
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good! 2012-03-20 11:54:03
首先,完整的膜蛋白是不可能分泌表达的(你是指将膜蛋白表达在CHO细胞的细胞膜上吧?)。既然是膜蛋白,就用它自身的信号肽就好了。
表达时载体的确很重要,但也得分情况的:
如果你是想构建稳定的细胞株,那么你可以考虑用pcDNA3.1,也可以考虑用invitrogen的FlP-IN系统,更容易获得高表达细胞株;
如果是做瞬时表达,那么建议你用invitrogen的MembranePro™ Functional Protein Expression (FPE) System。
2楼2012-03-19 21:36:01
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若然飞翔

新虫 (初入文坛)

还想再请教一下,我的老板的意思是去掉自身的信号肽,连入一段分泌信号肽完成分泌表达,可行么?还有就是pcDNA3.1是不是既可以用于稳定表达又可以用于瞬时表达啊,我是只瞬时表达在胞外检测到就可以,并且实验室有这个载体,我可以用么?
3楼2012-03-20 08:41:10
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若然飞翔

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-03-19 21:36:01:
首先,完整的膜蛋白是不可能分泌表达的(你是指将膜蛋白表达在CHO细胞的细胞膜上吧?)。既然是膜蛋白,就用它自身的信号肽就好了。
表达时载体的确很重要,但也得分情况的:
如果你是想构建稳定的细胞株,那么你 ...

还想再请教一下,我的老板的意思是去掉自身的信号肽,连入一段分泌信号肽完成分泌表达,可行么?还有就是pcDNA3.1是不是既可以用于稳定表达又可以用于瞬时表达啊,我是只瞬时表达在胞外检测到就可以,并且实验室有这个载体,我可以用么?
4楼2012-03-21 08:01:57
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